Histopaque® 故障排除指南

作者: Mark Frei , BioFiles v6 n5,14–16

 BioFiles 第 6 卷,5 号 — 离心

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以下关于在细胞分离技术中使用 Histopaque 和 ACCUSPIN™ 的故障排除建议已由 Sigma-Aldrich® 技术服务部门编译。这些指南均来自于解决客户问题的观察和经验。本指南针对使用 Histopaque 时观察到的最常见错误来源提出解决方案,但这并不代表本指南是全面无遗的。

使用 Histopaque/ACCUSPIN 时观察到的典型问题
血液或细胞样本故障排除提示
 Histopaque/ACCUSPIN 故障排除提示
技术故障排除提示
材料

 

 使用 Histopaque/ACCUSPIN 时观察到的典型问题

  • 从人体血液中分离单核或多形核细胞的困难
  • 从大鼠或小鼠血液中分离单核或多形核细胞的困难
  • 低恢复
  • 分离细胞中的红细胞、血小板或中性粒细胞污染

 血液或细胞样本故障排除提示

 

原因 解决措施
分离前 >24 小时抽血 分离前 2-6 小时抽血。抽血 >24 小时将更难分离,回收率和存活率将更低。
由于没有抗凝剂,血液已凝固 建议使用带预测值抗凝剂的真空管。不建议使用注射器(不含抗凝剂)。
由于混合不完全,血液已经凝固 确保抽完血后真空管与抗凝剂充分混合。
使用的抗凝剂不适用于 Histopaque 分离应用 以下抗凝剂适用于 Histopaque:

      • 每毫升全血含有 15-30 单位肝素
      • 每毫升全血中含有 1.25-1.75 mg EDTA

ACA-A(酸性柠檬酸葡萄糖配方 A)可用作抗凝剂。分离后,产生的单核细胞带将比其他抗凝剂更宽。这是正常的,细胞可以使用。
抽血后血液样本温度过高,分离尝试太快 红细胞污染可能是因为血液不在室温下而产生的。

抽血后,应让血液在室温下至少冷却 30-45 min。如果在取材后立即使用,采集的单个核细胞数量会很低。当血液和 Histopaque 都在 18-20°C 时,分离程序是最佳的,可接受的温度范围为 18-26°C。
用高盐浓度 PBS 稀释血样 与 Histopaque 一起使用的历史细胞分离技术包括用 PBS (1:1) 稀释血液。随后,我们发现并非所有的 PBS 配方都适用于 Histopaque。

含有 150 mm 磷酸盐缓冲液和 150 mm 氯化钠的溶液是盐浓度太高而不能与 Histopaque 一起使用的 PBS 溶液。接近 10 mm 磷酸盐的 PBS 摩尔浓度更适合与 Histopaque 一起使用。当用合适的细胞培养基代替高盐浓度的 PBS 时,细胞活力将保持较高水平。
供体血液生理学的差异(当单个样本的恢复较差时) 高血脂、类风湿因子、贫血和药物治疗都可能是导致特定供者血液分离不良的原因。

如果血浆不清澈,则表明血脂水平过高。
小动物样品被其他液体或固体污染 由于在采集的血液中存在毛发和其他体液,因此从非针方式采血(例如通过尾部取样)获得的血液通常不可用。这通常引发凝血级联反应,产生凝血。

建议处死动物,通过主动脉或腔静脉或其他大血管获取血液。或者,可以使用儿科真空管抽血。
高水平白细胞样本中白细胞的闭塞 当红细胞与多聚蔗糖接触时可形成聚集体,导致白细胞闭塞。一旦被困在这些聚集体中,白细胞就会移动到离心管的底部。

对于常规血液标本,未稀释血液的回收率通常会更高。但应稀释骨髓、脐带血和白细胞计数异常增高的供者样本,以缩小红细胞聚集体的体积,提高白细胞的回收率。
血液稀释不当或用污染的 PBS 或培养基稀释 在 Histopaque® 上样前稀释血液时,缓冲液或培养基配方有可能与 Histopaque 不相容,或者 PBS 或细胞培养基被污染。

如果血液已经被稀释且收率很差,则重复实验,不进行样品稀释。
使用含有 FBS 或其他载体蛋白的细胞培养基进行稀释 当稀释样品用于 Histopaque 时,不含 FBS 的细胞培养基可替代 PBS。如果用含有 FBS 的细胞培养基稀释血液,回收的细胞数会更低。

在分离细胞并至少洗涤一次以除去 Histopaque 后,可将 FBS 加入到培养基中用于随后的洗涤或储存。第一次洗涤后,在洗涤介质中加入 FBS 等蛋白质,将进一步保护细胞免受损伤。
用 Histopaque 从白膜层中分离细胞 在合适的抗凝剂中采集血液并离心制备白膜层。红细胞会沉淀到试管的底部。紧靠红细胞层上方将是一个灰色层。这个灰色层是白膜层,代表了血液中所有的白细胞。在灰色层上面的是血浆。

用新鲜血液制备的白膜层适合使用 Histopaque 进行分离。如果细胞是几天龄的,例如,如果白膜层是从捐献的血液单位获得的,细胞可能无法提供可接受的收率。

在加载到 Histopaque 梯度之前,必须将白膜层至少稀释 1:2 或 1:4。
使用 ACCUSPIN™ 试管从白膜层分离细胞 白膜层制剂不能用于 ACCUSPIN 管。ACCUSPIN 试管需要一定数量的红细胞才能正常工作,而白膜层缺乏足够用于 ACCUSPIN 试管的红细胞。

 

 Histopaque/ACCUSPIN 故障排除提示

 

原因 解决措施
Histopaque的细菌污染 Histopaque 是作为无菌溶液制造的。没有防腐剂,以减少污染的机会。如果怀疑有污染,请使用新鲜的 Histopaque 瓶。
Histopaque 温度太低 如果使用冷的 Histopaque 或填充的 ACCUSPIN 试管,收率通常很低,并可观察到细胞结块。红细胞污染也可能是因为 Histopaque 不在室温下产生的。

执行规程时温度非常重要。在 2-8°C 条件下储存的 100 mL 或 500 mL 瓶装 Histopaque 可能需要几个小时才能达到 18-20°C。在计划使用 Histopaque 时,我们建议前一天从冰箱中取出 Histopaque,将瓶子放在长凳上静置过夜。这样可以确保溶液处于室温并随时可用。

另一种选择是将适量的 Histopaque 转移到每个离心机或 ACCUSPIN 管中,这样较小的体积将更快转变为室温。

采集细胞带并进行第一次洗涤后,刻在在 4°C 下进行剩余的洗涤步骤。

 

 技术故障排除提示

 

原因 解决措施
在 Histopaque 上分层血液后延迟处理样品 当将血液分层到用于单核细胞的梯度上时,不需要精确分层。如果在血液和 Histopaque 之间发生一点混合,细胞带仍然会正常形成。

一旦血液分层,务必立即将离心管放入离心机。如果时间太长,整层的 Histopaque 会被红血球染成红色。在一定的“形成液滴”的数量下,这可能会降低单核细胞的回收率。应限制一次处理的试管数量,以减少这种细胞扩散。
分离中性粒细胞时 Histopaque ® 1077 和 Histopaque 1119 的分层不当 当同时使用 Histopaque 1077 和 Histopaque 1119 分离中性粒细胞时,必须谨慎操作来防止溶液界面的混合。

使用纹影光学技术检查界面的完整性。拿着试管对光观察时,任何两层之间界面处的旋涡或混合都应该是明显的。如果界面制备得当,应该有一个清晰的界限。

如果不存在清晰的分界线,或者在界面处存在旋涡,则丢弃试管并重新开始。

梯度形成后,使用梯度也很重要。1077 和 1119 之间没有化学差异;这两种解决方案具有相同的组分,并将随着时间开始一起扩散。当这种情况发生时,恢复将很差或根本不存在。
使用的粉末对有粉手套的污染。 不应使用有粉手套。手套粉末会导致细胞聚集。仅限使用无粉手套。
使用的离心力不正确 应检查离心机以确保正确校准。过强的力(较高的离心速度)会降低收率。
使用前将 Histopaque 高压灭菌 Histopaque 不能通过高压法灭菌;高压灭菌会使溶液中的多聚蔗糖焦糖化,使其变成棕色。可通过 0.22 微米过滤器无菌过滤 Histopaque。
分离后细胞内的血小板或中性粒细胞污染 血小板污染或中性粒细胞污染一般是因为采集细胞带时采集过多血浆或 Histopaque 1077 或 1083 而产生的。减少采集血浆或 Histopaque 的量。
用于清洗细胞聚合体的容量过大 洗涤细胞聚合体通常会去除血小板。如果在细胞聚合体上留下大量的洗涤液,将导致细胞悬液中血小板增多。

在不干扰细胞聚合体的情况下,尽可能多地去除洗涤介质。血小板在 1000×g 的离心力下作用 10 min 通常不会聚合。在建议的洗涤步骤的较低离心速度下,血小板应保持悬浮在洗涤介质或上清液中。
细胞聚合体不形成单细胞悬液 重新悬浮细胞聚合体时,只需使用少量洗涤液。在 15 mL 或 50 mL 离心管中进行操作时,我们建议洗涤介质不超过 0.5 mL。在颗粒上轻轻冲洗这种洗涤介质。

可能需要将细胞悬液抽入吸管并分装数次。一旦细胞处于单细胞悬液中,可以加入剩余的洗涤液并将溶液离心。
由于与离心管壁粘附而导致洗涤过程中细胞的损失 细胞偶尔会粘在离心管的壁上。如果细胞确实粘附在聚苯乙烯管上,管子就会显得浑浊。

换用另一批聚苯乙烯离心管或改用另一种塑料,如聚乙烯。聚苯乙烯管中发生这种问题的情况最多,但其他类型的塑料也有报道出现细胞粘附的问题。

 

 材料