NIR萤光染料

作者:Monika BaeumleBioFiles 2009, 4.1, 6.


 Tracy 645 和 Tracy 652

生命科学应用(例如抗体和蛋白质标记)对红色荧光染料的需求日益增长,这促使我们开发新的和改进的用于可见光 / 近红外(NIR)区域的长波长标记物。

Tracy 645和Tracy 652(参见表1)是专为满足NIR荧光染料需求而开发的专有染料。Tracy染料:

  • 能够在蛋白质标记条件(碱性pH,可防止导致标记效率低下的染料分解或水解)下保持活化的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的化学稳定性。
  • 耐光。
  • 易溶于作为活化NHS酯的水性标记介质,减少会导致蛋白质标记效率低下的沉淀。
  • 灵活用于典型的蛋白质标记方案。

背景荧光的减少是由于瑞利和拉曼散射的大大减少,这是通过转移到较长波长激发、以及减少从该区域中样品杂质的自发荧光来实现的。

 

表1. Tracy荧光团的光谱数据,可用于计算缀合物的染料 / 蛋白质比例。

红色荧光染料优于传统短波长染料的几个主要优点,使得Tracy染料对细胞和分子生物学或生物分析研究具有极大的吸引力1-3

  • 背景低,因而灵敏度高。
  • 在各种染料 / 蛋白质比例下,标记的蛋白质都有强荧光信号。
  • 低成本、可靠的激光二极管可用作激发源,而不是寿命短又昂贵的气体激光器。

在上述所有标准中,Tracy 652和Tracy 645都优于传统的荧光标记,如Cy® 5(参见图1)。相应类型的其他更现代的标签甚至也会不满足上述一项或多项标准。 

Tracy 652染料与Cy® 5的耐光性。

 

 

图1. Tracy 652染料与Cy® 5的耐光性。

用375W白光灯照射白色Pyrex烧瓶中甲醇中的每种染料的1 mM溶液;灯与探针之间的距离为20厘米;探针保持在室温;在每种染料的λex,max和λem,max处测量。

对Tracy染料的抗体缀合物的最佳染料 / 蛋白质(D/P)比例的研究显示在~4:1 D/P下产生最大发射强度。

带有Tracy染料的二抗缀合物可用于免疫染色应用,用荧光显微镜观察(参见图2)。

 

免疫组织染色(2通道模式)后大鼠胃切片的共聚焦显微图像(CLSM)。绿色通道:细胞角蛋白染色。一抗:来自兔的抗细胞角蛋白;二抗:用Atto 488染料(λex 488 nm)标记的抗兔IgG。红色通道:肌动蛋白染色。一抗:来自小鼠的抗肌动蛋白;二抗:用Tracy 645染料(λex 543 nm)标记的抗小鼠IgG。

 

图2. 免疫组织染色(2通道模式)后大鼠胃切片的共聚焦显微图像(CLSM)。绿色通道:细胞角蛋白染色。一抗:来自兔的抗细胞角蛋白;二抗:用Atto 488染料(λex 488 nm)标记的抗兔IgG。红色通道:肌动蛋白染色。一抗:来自小鼠的抗肌动蛋白;二抗:用Tracy 645染料(λex 543 nm)标记的抗小鼠IgG。

此外,能够选择性地检测固体表面(例如凝胶或蛋白印迹)上的His标记蛋白的NTA(次氮基三乙酸酯)-Tracy衍生物,也可以在我们的产品目录中找到(参见图3)。

 

 His标记的p38-MAPK蛋白(25 ng - 500 ng )在4-20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上分离。将凝胶固定在40%乙醇 / 10%乙酸中过夜,然后在水中洗涤,并在黑暗中与Ni-NTA-Tracy 652(1:1000)一起孵育。洗涤凝胶,然后使用具有633 nm激发和675 nm发射滤光器的FLA-3000 Fuji® 激光扫描仪成像。Ni-NTA-Tracy 652(λex 652 nm,λem 677 nm)在光谱的红色区域被激发。

 

图3. His标记的p38-MAPK蛋白(25 ng - 500 ng )在4-20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上分离。将凝胶固定在40%乙醇 / 10%乙酸中过夜,然后在水中洗涤,并在黑暗中与Ni-NTA-Tracy 652(1:1000)一起孵育。洗涤凝胶,然后使用具有633 nm激发和675 nm发射滤光器的FLA-3000 Fuji® 激光扫描仪成像。Ni-NTA-Tracy 652(λex 652 nm,λem 677 nm)在光谱的红色区域被激发。

 

与蛋白印迹上基于化学发光的传统检测方法相比,这种His标记蛋白的检测方法的主要优点是,该方案简单、有效,但是以一些灵敏度为代价。

Tracy 652已用于双色多重免疫印迹:在4-20% Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上分离5至500 ng量的蛋白质1和2,然后转移至低荧光PVDF膜。用PBS中的5% BSA封膜,分别与针对蛋白质1和2的抗体一起孵育,并用缀合了荧光染料Atto 550(绿色)和Tracy 652(红色)的相应二抗进行探测(参见图4)。 

 

 使用两种一抗和两种抗IgG染料缀合物对蛋白1和蛋白2进行免疫印迹检测。使用FLA-3000 Fuij® 激光扫描仪进行系列成像。Atto 550的第一幅图像:λex 532 nm,具有580 nm发射滤光片。Tracy 652的第二幅图像:λex 633 nm,具有675 nm发射滤光片

图4. 使用两种一抗和两种抗IgG染料缀合物对蛋白1和蛋白2进行免疫印迹检测。使用FLA-3000 Fuij® 激光扫描仪进行系列成像。Atto 550的第一幅图像:λex 532 nm,具有580 nm发射滤光片。Tracy 652的第二幅图像:λex 633 nm,具有675 nm发射滤光片

 


 材料

     


 参考文献

  1. Wolfbeis, O.S., Fluorescence Spectroscopy: New Methods and Applications, Springer, Heidelberg, (1993).
  2. Rettig, W. and B. Strehmel, B., Applied Fluorescence in Chemistry, Biology and Medicine, Springer, Heidelberg, (1999).
  3. Mason, W.T. (ed.), Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity, 2nd ed., Academic Press, (1999).
  4. Calculation of the dye/protein ratio [D/P or DOL] and the protein concentration [cprotein] of labeled protein is according to Mujumdar, R.B., et al., Bioconj. Chem., 4, 105 (1993).