Ni-NTA-Atto共轭物

生物档案 2007,2.5,12。


 Ni-NTA-Atto共轭物 ,用于灵敏、特异地检测多聚组氨酸标签蛋白

最先进的重组蛋白应用需要可靠的检测方法。聚组氨酸是重组蛋白中最常用的亲和标记物之一。它可以插入 N 端或 C 端,并在多种宿主中表达。由于其体积较小,多组氨酸标记物可作为蛋白质纯化和检测的适用工具。免疫印迹法检测 His 标记的融合蛋白通常使用多聚组氨酸的抗体,然后使用与诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的酶缀合的第二抗体。然后用合适的酶基质检测蛋白质。

Ni-NTA-Atto共轭物为 His 标记的融合蛋白提供特异性和高灵敏度的检测。Ni-NTA-Atto 复合物(Nα,Nα-双(羧甲基)-L-赖氨酸,与 Atto 染料结合的镍 (II) 复合物)对多组氨酸标记物具有特异性,交叉反应性最小。Atto染料在通常可用的波长下提供强荧光信号并且几乎没有猝灭。Ni-NTA-Atto共轭物可直接应用于 SDS-PAGE 凝胶或 Western blot 膜进行荧光成像,并已成功用于活细胞。1,2  用 Ni-NTA-Atto共轭物检测比蛋白-抗体结合需要更少的培养时间。不需要二次反应,因为 Ni-NTA 复合物直接与荧光团结合。与传统的免疫检测方法相比,这种方法更快速、更灵活(参见   图 1)。

 

传统抗体化学发光免疫检测(左)与 Ni-NTA-Atto 结合物检测(右)的蛋白检测比较。

图 1.  传统抗体化学发光免疫检测(左)与 Ni-NTA-Atto 结合物检测(右)的蛋白检测比较。免疫检测发生在蛋白印迹后的转移膜上,而 Ni-NTA-Atto 结合物可以与转移膜一起使用,也可以在固定后直接在 SDS-PAGE 凝胶上使用。


 在 SDS-PAGE 凝胶上直接检测组氨酸标记蛋白

将 Ni-NTA-Atto 偶联物直接应用于 SDS-PAGE 凝胶,为在不同时间点监测蛋白纯化或蛋白表达提供了快速、简便的检测方法。使用荧光成像观察到His标记的p38MAPK的检测限为50ng(见   图 2)。

 

在 SDS-PAGE 凝胶上直接检测组氨酸标记蛋白

图 2.  在 4-20%Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 凝胶上分离 His 标记的 p38 MAPK 蛋白 (500 ng–25 ng)。将凝胶在 40% 乙醇/10% 乙酸中固定过夜,在水中洗涤并在黑暗中与 Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) 一起温育。清洗凝胶,然后使用 FLA-3000 Fuji®   激光扫描仪成像,激发波长为 633 nm,发射滤光片为 675 nm。Ni-NTA-Atto 647N(λex 647 nm, λem 669 nm)在光谱的红色区域被激发。


 免疫印迹法检测组氨酸标记蛋白

电泳后,蛋白可能会从 SDS-PAGE 凝胶转移到低荧光 PVDF 膜上,处理起来更加稳健。传统的蛋白质印迹法适用于多聚组氨酸标记物,但比较费时。Ni-NTA-Atto共轭物同时具备高度特异性检测和更快速的优点。

将Ni-NTA-Atto共轭物应用于膜可获得与直接凝胶检测相当的灵敏度。干燥膜可增强信号强度(参见   图 3)。另外,Ni-NTA-Atto共轭物可以在 20 mm EDTA 中孵育 60-90 分钟后从使用过的膜上剥离下来。

 

免疫印迹法检测组氨酸标记蛋白

 

图 3.  在 4-20%SDS-PAGE 凝胶上分离 His 标记的 p38 MAPK 蛋白 (500 ng–25 ng)。将蛋白转移到低荧光 PVDF 膜上,用 PBS 中的 5%BSA 封闭过夜,用 PBS-T 漂洗,并在黑暗中与 Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) 一起温育。清洗膜,然后使用 FLA-3000 Fuji® 激光扫描仪成像,激发波长为 633 nm,发射滤光片为 675 nm。

传统的 Western 免疫印迹和Ni-NTA-Atto共轭物的步骤比较见   表 1。直接 SDS-PAGE 凝胶检测最方便,因为它省略了转移步骤。与 SDS-PAGE 凝胶相比,Western 印迹膜观察到与Ni-NTA-Atto共轭物相似的检测限,但没有凝胶损坏的风险。无论哪种情况,动手操作时间都少于传统抗体技术。

 

 

表 1.  传统 Western 免疫印迹、使用Ni-NTA-Atto共轭物的 Western 印迹和使用Ni-NTA-Atto共轭物在 SDS-PAGE 凝胶上直接检测的方案比较。Ni-NTA-Atto 原液是通过将 250 μg 溶于 250μlpbs 中制备的。

Ni-NTA-Atto 偶联物为传统抗体免疫检测提供了一种有价值的替代方法,用于特异性和灵敏地检测 His 标记的融合蛋白。Ni-NTA-Atto 的使用减少了实验时间,省去了耗时的抗体验证实验,既节省时间又节省费用。


 材料

     


 参考文献

  1. Single Molecule Detection with Atto 647N NTA, BioFiles, Issue 3, pp. 8-9, Sigma-Aldrich (2006).
  2. Guignet, E.G., et al., Reversible site-selective labeling of membrane proteins in live cells. Nat. Biotechnol., 22, 440-4 (2004).