色谱柱填充和抗体亲和层析的制备

附录5,摘自亲和层析卷 1:抗体,GE Healthcare,2016


 

GE预装的色谱柱可以确保结果的可重复性和性能的最优化。

使用小型预装柱进行色谱介质筛选和方法优化并提高方法开发的效率。

高效的色谱柱填充对于气相色谱分离至关重要,尤其是在梯度洗脱时。填充不良的色谱柱会导致流动性差,流量不均匀,带宽变宽,分辨率降低。如果需要填充色谱柱,则可以依据以下适用于所有规模操作的准则:

  • 高粘合力的介质应使用短而宽的色谱柱(通常为5至15 cm床高)进行快速纯化,无论流速快慢。
  • 所需的气相色谱介质的量取决于介质的结合能力和样品数量。本手册列出了每种介质的结合能力,并随产品说明书提供。估计结合目标样品所需的介质的量,并使用该量的五倍来填充色谱柱。如果分辨率达到要求,则可以减少所需的介质量。
  • 确定分离参数后,通过增加色谱柱直径,进而增加色谱柱体积来达到扩大纯化规模的目的。尽可能不要增加色谱柱的长度,因为这样会改变分离条件。

 

气相色谱介质可以封装在GE提供的Tricorn,XK或HiScale色谱柱中(图A5.1)

Column packing in progress.

 

图A5.1.色谱柱填充中。

1.        将所有材料平衡至分离所需的温度。

2.        用推荐的缓冲液冲洗色谱柱末端除去空气。确保柱网下方没有空气。关闭柱出口并在柱中留下1至2厘米的缓冲液。

3.        轻轻地重新悬浮介质。

请注意GE提供的气相色谱填料是即用型,无需弃去可能堵塞色谱柱的细菌。

应避免使用磁力搅拌器,否则会损坏色谱基质。

4.        根据说明书中提供的建议估算所需的浆料(重悬填料)的量。

5.        将所需体积的浆料倒入色谱柱中。沿着贴在柱内壁上的玻璃棒倒入以减少气泡的引入。

6.        立即用缓冲液填充色谱柱。

7.        安装色谱柱顶部件/适配器并连接到泵。

8.        打开色谱柱出口并将泵设置为所需的流速(例如,在XK 16/20色谱柱中为15 ml / min)。

当浆料体积大于色谱柱的总体积时,连接第二个玻璃柱作为储液器(相关详细内容请参阅订购信息)。这样就确保了浆料在填充期间具有恒定的直径,从而将湍流最小化并改善了色谱柱的填充条件。

若无法调至推荐的流量,请调至泵可以承载的最大流量。

9.        获得恒定床高后,保持填料流速至少为3 CV。标记色谱柱上的床高。

任何纯化过程中不得超过70%的填充流量。

10.       停止泵运转并关闭色谱柱出口。如果使用了第二个色谱柱:取下顶部部件,并用缓冲液小心地填充色谱柱的其余部分并在顶部形成向上的弯液面。将适配器以一定角度插入色谱柱,确保网下没有空气。

11.       将适配器缓慢向下滑入色谱柱(适配器的出口应打开)直达标记。锁定适配器锁位置。

12.       将色谱柱连接到泵并开始平衡。必要时重新定位适配器。

 

填料须经过彻底清洗以除去储存溶液,通常是20%乙醇。残留的乙醇会干扰后续步骤。

许多经过含有抗菌剂的无菌磷酸盐缓冲盐水平衡的色谱填料可以在4°C下储存长达1个月,但仍须遵循产品附带的储存专门说明。

 

色谱柱填充和效率

色谱柱效率表示为每米色谱床的理论塔板数(N)或H(相当于理论塔板的高度,HETP),即床长度(L)除以塔板数。色谱柱效率与色谱柱上可能出现的谱带展宽有关,可以从表达式计算得出:

N = 5.54 × ( VR
——
Wh
)2

VR =从样品开始注入到最大峰值洗脱的体积

wh =峰宽测量为峰高的一半处记录峰的宽度

 

H由表达式计算

H = L
N

L = 填充床的高度。



VR和wh的测量单位可以是距离(mm)或体积(ml),但两个参数必须以相同的单位表示。

应定期检查色谱柱性能,注入丙酮以确定色谱柱效率(N)和峰对称性(不对称因子,As)。由于N的观测值取决于实验因素,如流速和样品加载,因此必须在相同条件下进行比较。在气相色谱中,通过注入丙酮(不与填料相互作用)并在等度条件下测量洗脱峰来测量效率,如图A5.2所示。

图A5.2. 用于计算色谱柱效率的测量值。

 

一般来说,良好的H值约为填充填料平均粒径的2-3倍。对于90μm的填充颗粒,H值应为0.018至0.027cm。

不对称因子(As)表示为:

As = b
a

 

其中

a =峰值高度的10%处的前半峰宽

b =峰高10%处的第二半峰宽

 

As应该尽可能接近1.0。气相色谱中使用的短柱的合理As值应为0.80至1.80。

过长的前沿通常表明填料填充过于紧实,拖尾通常表明填料填充过于松散。

新填充的色谱柱应运行至少2 CV的缓冲液,以确保填料与初始缓冲液平衡。使用pH监测来检查洗脱液的pH值。

 

自定义色谱柱填充

当标准产品组合中没有合适的色谱填料和色谱柱或板时,我们还提供实验室色谱柱填充或96孔板填充的服务。定制产品组将与您密切合作,提供满足特殊纯化要求的填充柱。

 

色谱柱选择

Tricorn,XK和HiScale色谱柱可以完全兼容现代填料承载的高流速,并有多种尺寸可供选择(见表A5.1)。

大多数情况下,填料的结合能力和待纯化的样品量将决定所需的色谱柱尺寸。此外,Empty Disposable PD-10色谱柱可用于使用重力流的一次性应用。

 

表A5.1. 柱床体积和高度

  色谱柱尺寸   床体积(mL)   床高(cm)  
i.d. (mm) 长度  
Tricorn 5/20 5 20 mm 0.3 - 0.5 1.6 - 2.8
Tricorn 5/50 5 50 mm 0.9 - 1.1 4.6 - 5.8
Tricorn 10/20 10 20 mm 1.2 - 2.2 1.6 - 2.8
Tricorn 10/50 10 50 mm 3.6 - 4.5 4.6 - 5.8
Tricorn 10/100 10 100 mm 7.5 - 8.5 9.6 - 10.8
XK 16/20 16 20 cm 5.0 - 31.1 2.5 - 15.5
XK 16/40 16 40 cm 45.2 - 70.3 22.5 - 35.0
XK 26/20 26 18 cm 5.3 - 66.3 1.0 - 12.5
XK 26/40 26
 
40 cm 122.1 - 185.7 23.0 - 35.0
XK 50/20 50 18 cm 0 - 274.8 0 - 14.0
XK 50/30 50 30 cm 274.8 - 549.5 14.0 - 28.0
HiScale 16/20 16 200 mm 0 - 40.2 0 - 20.0
HiScale 16/40 16 400 mm 16.1 - 80.4 8.0 - 40.0
HiScale 26/20 26 200 mm 0 - 106.1 0 - 20.0
HiScale 26/40 26 400 mm 69.0 - 212.3 13.0 - 40.0
HiScale 50/20 50 200 mm 0 - 392.5 0 - 20.0
HiScale 50/40 50 400 mm 274.8 - 785.0 14.0 - 40.0
Empty Disposable PD-102 15 7.4 cm 8.3 4.8 - 5.0

1 当使用一个适配器时,适用Tricorn和XK色谱柱规范。当使用两个适配器时,HiScale色谱柱规范适用。
2 适用于重力流应用。与LabMate 缓冲液储液器(参见订购信息)联用,可以加载多达25 ml的缓冲液和/或样品,大大减少了处理时间。

 

蛋白G和蛋白A 琼脂糖填料的清洗

纯化后,填料应按照下列步骤再生

1.        洗脱后,用2至3倍柱体积的洗脱缓冲液洗涤。

2.        立即用2至3倍柱体积的结合缓冲液洗涤,重新平衡。



就地清洗

观察到背压增加时,应清洗填料。在某些应用中,诸如变性蛋白质或脂质等物质在再生过程中不会被洗脱。

去除沉淀或变性的蛋白质:

1.        用2倍柱体积的6M盐酸胍洗涤基质。

2.        立即用至少5倍柱体积的结合缓冲液洗涤。

去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂质:

1.        用非离子除垢剂(例如0.1%Triton X-100)在37°C洗涤1分钟。

2.        立即用至少5倍柱体积的无菌结合缓冲液洗涤。
a) 也可用70%乙醇洗涤柱子并静置12小时。

处理后,用至少5倍柱体积的结合缓冲液洗涤。

 


反向流动可以提高就地清洗步骤的效率。清洁后,储存在20%乙醇中。

使用70%乙醇洗涤会增加背压。当用70%乙醇清洁时,使用较低的流速。

 

清洁MabSelect填料

通过以下步骤可以清洁所有的MabSelect填料:

去除沉淀或变性物质:

1.        用2倍柱体积的50mM氢氧化钠在500mM硫酸钠或50mM氢氧化钠的1M氯化钠,或100mM磷酸钠或6M盐酸胍的10mM氢氧化钠溶液中洗涤培养基。 接触时间:至少10分钟。

2.        立即用至少5倍柱体积的无菌过滤结合缓冲液在pH7.0至8.0下洗涤。

 

MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX耐碱性,可以使用更高浓度的氢氧化钠溶液洗涤:

1.        用3倍柱体积的结合缓冲液洗涤。

2.        用至少2倍柱体积的100mM至500mM氢氧化钠洗涤。接触时间:10至15分钟。

3.        立即用至少5倍柱体积的无菌过滤结合缓冲液在pH7.0至8.0下洗涤。

 

去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂质:

1.        用2倍柱体积的非离子除垢剂(例如0.1%溶液)洗涤。

2.        立即用至少5倍柱体积的无菌过滤结合缓冲液在pH7.0至8.0下洗涤。

a)  也可用3至4倍柱体积的70%乙醇或30%2-丙醇洗涤。立即用至少5倍柱体积的无菌过滤结合缓冲液(pH7.0至8.0)洗涤。当使用高浓度的有机溶剂时,应增加梯度以避免气泡形成。

使用70%乙醇和30%2-丙醇洗涤将增加背压。当用70%乙醇或30%2-丙醇清洁时,使用较低的流速。

 

材料