抗体亲和色谱的脱盐和缓冲液置换

摘自《亲和色谱》第1卷:抗体,GE Healthcare,2016

 

一般注意事项

实验室规模的脱盐是一种成熟、简单、快速的方法,可以在将样品转移至所需缓冲液的同时快速去除低分子量污染物。

GE提供了一系列预装柱和96孔过滤板,既可用于手动色谱系统,也可以用于高通量应用(表2.8)。这些产品包含阻色谱(SEC,也称为凝胶过滤)介质Sephadex™ G-25,能够从分子量大于5000的抗体中高效去除低分子量物质。

可视需要在纯化步骤之前和/或之间进行脱盐/缓冲液置换。切记,每个额外步骤都会降低得率,并且脱盐通常会稀释样品(离心方案不会稀释样品)。

从分子量大于5000的蛋白质中去除盐和其他低分子量化合物。

 

 

表2.8. 脱盐/缓冲液置换柱的选择指南

 

脱盐柱和96孔板   介质 上样体积(ml) 洗脱体积(ml) 稀释系数   操作  
HiTrap® Desalting Sephadex™ G-25 Superfine 0.25 1.0 4 注射器/泵/色谱系统
注射器/泵/色谱系统
0.5 1.5 3 注射器/泵/色谱系统
1.0 2.0 2 注射器/泵/色谱系统
1.5 (max.) 2.0 1.3 注射器/泵/色谱系统
2× HiTrap®脱盐 Sephadex™ G-25 Superfine 3.0 (max.) 4.0 - 5.0 1.3 - 1.7 注射器/泵/色谱系统
3× HiTrap®脱盐 Sephadex™ G-25 Superfine 4.5 (max.) 6.0 - 7.0 1.3 - 1.7 注射器/泵/色谱系统
HiPrep™ 26/10脱盐 Sephadex™ G-25 Fine   10 10 to 15 1.0- 1.5 泵/色谱系统
15 (max.) 15 - 20 1.0 - 1.3 泵/色谱系统
2x HiPrep™ 26/10脱盐 Sephadex™ G-25 Fine 30 (max.) 30 - 40 1.0 - 1.3 泵/色谱系统
3x HiPrep™ 26/10脱盐 Sephadex™ G-25 Fine 45 (max.) 45 - 55 1.0 - 1.2 泵/色谱系统
4x HiPrep™ 26/10脱盐 Sephadex™ G-25 Fine 60 (max.) 60 - 70 1.0 t- 1.2 泵/色谱系统
PD SpinTrap™ G-25 Sephadex™ G-25介质 0.1 - 0.18 0.1 - 0.18 未稀释 离心
PD MultiTrap™ G-25 Sephadex™ G-25介质 0.07 -0.13 0.07 - 0.13 未稀释 离心
PD MiniTrap™ G-25 Sephadex™ G-25 介质 0.2 - 0.5

0.1 to 0.5
0.1 - 0.5
0.1 to 0.5
0.1 - 0.5

1.0
未稀释

2
离心
重力流
PD MidiTrap™ G-25 Sephadex™ G-25 介质 0.5 to 1.0

0.1 - 0.5-
0.5 -1.0

1.5
未稀释

1.5
离心

重力流
PD-10 脱盐柱 Sephadex™ G-25介质 1.0    to 2.5
1.0    - 2.5

0.1 to 0.5
0.1 - 0.5
1.0 t- 2.5-
3.5
未稀释

1 - 1.5-
离心离心

重力流

 

脱盐柱可以处理高达脱盐柱总体积30%的样品。如此高速度和高容量的分离可在实验室快速、高效地处理更大体积的样品。使用正常水性缓冲液时,只要抗体浓度不超过约70 mg/ml, 并且抗体在所用浓度下稳定且可溶,样品浓度就不会影响分离效果。

 

如果脱盐是第一个色谱分析步骤,则应该先对样品进行分类;建议采用离心和/或过滤法。

 

如果需要使用挥发性缓冲液,请使用100 mM醋酸铵或100 mM碳酸氢铵。

透析通常速度较慢,需要使用大量缓冲液,并且在处理过程中有损失材料的风险。与透析相比,脱盐具有多种优势。

在实验室规模下,如果过滤和离心后的样品比较干净,则可以省去缓冲液置换和脱盐步骤。对于AC或IEX,可能只需要调整样品pH,并且可根据需要调整离子强度。

有时,通过稀释降低离子强度、在HIC之前添加硫酸铵或通过滴定调节pH,可省去缓冲液置换步骤。

 

样品的小规模脱盐

对于0.2 -2.5 ml的样品体积,可以使用PD-10脱盐柱、PD MidiTrap™ G-25和PD MiniTrap™ G-25重力流脱盐柱平行处理多个样品。这些重力流脱盐柱具有两种方案:一种用于实验台手动操作;另一种用于标准离心机和离心接头的组合。

对于100-180 µl的较小样品体积,可以使用PD SpinTrap™ G-25纯化柱及微量离心机或PD MultiTrap™ G-25 96孔板的组合进行离心提取(图2.2)。

PD SpinTrap, MultiTrap, MidiTrap, and MiniTrap G-25

图2.2. (A) PD SpinTrap™ G-25样品制备。 (B) 利用机械臂系统进行PD MultiTrap™ G-25样品自动化制备。(C和D) 在标准离心机中,使用离心接头结合PD-10脱盐柱、PD MidiTrap™ G-25以及PD MiniTrap™ G-25。



使用HiTrap®和HiPrep™脱盐柱对较大体积样品进行脱盐

 

最多可将三个HiTrap® 脱盐柱串联,以增加样品体积容量,例如,两个脱盐柱串联可容纳的样品体积为3 ml,三个脱盐柱串联可容纳的样品体积为4.5 ml。

最多可将四个HiPrep™ 26/10脱盐柱串联,以增加样品体积容量,例如,两个脱盐柱串联可容纳的样品体积为30 ml,四个脱盐柱串联可容纳的样品体积为60 ml。即使使用四个脱盐柱串联,也依然可以在20-30分钟内完成样品处理(表2.8)。

缓冲液制备

对于具有带电基团的物质,建议使用含有缓冲盐的洗脱液。建议盐浓度至少为150 mM,以防止可能与介质发生离子相互作用。通常可以使用氯化钠。一般来说,缓冲液中的缓冲物质浓度为25-50 mM即可。

当盐浓度高于1 M时,疏水性物质可能延迟洗脱或与介质结合。在更高的盐浓度(高于1.5 M硫酸铵)下,脱盐柱介质会收缩。

 

样品制备

只要样品与所用缓冲液的粘度相差不超过1.5倍,样品浓度就不会影响分离效果。使用正常的水性缓冲液时,该粘度相当于最高蛋白质浓度70 mg/ml。

样品应完全溶解。如有需要,可在上样前离心或过滤(0.45 µm过滤器),以去除颗粒物。

蛋白质溶解度通常取决于pH和/或离子强度(盐浓度),因此,缓冲液置换可能导致蛋白质沉淀。此外,如果pH变化至超出蛋白质活性范围,则可能损失蛋白质活性。

下述方案描述了使用不同形式预装柱进行的脱盐和缓冲液置换。

 

使用HiTrap® 脱盐柱手动脱盐


HiTrap<sup>®</sup> Desalting column

图2.3. HiTrap®脱盐柱可与注射器、泵或色谱系统联用,实现高效、易于操作的分组分离。

HiTrap® 脱盐柱是一种采用经过测试验证的SEC介质Sephadex™ G-25 Superfine填充的5 ml柱(图2.3)。该介质是一种交联葡聚糖珠状凝胶,具有出色的分离度和高流速。该脱盐柱对球状蛋白质的分离范围介于Mr 1 000至5000之间,排阻极限约为Mr 5 000。这确保脱盐柱可对分子量大于5000的蛋白质/多肽与分子量低于1000的分子实现分组分离。

HiTrap®脱盐柱可与pH范围为2-13的水溶液一起使用。预装介质可在所有常用缓冲液、尿素溶液(8 M)、盐酸胍(6 M)以及所有非离子和离子去污剂中保持稳定。缓冲液或样品中可使用低碳醇(甲醇、乙醇、丙醇),但是我们建议将浓度控制在25% v/v以下。应避免长时间暴露(几小时)于pH值低于2或高于13的环境,或者氧化剂。

当需要完全去除低分子量组分时,建议样品体积范围为0.1-1.5ml。当流速在1-10 ml/min范围内时,分离效果不受流速影响。建议的最大流速为15 ml/min。使用注射器、泵或色谱系统,可轻松完成分离。最多可以串联三个脱盐柱,以便处理更大的样品量。

图2.4展示了使用HiTrap® 脱盐柱完成的经典脱盐和缓冲液置换分离,并通过追踪紫外吸收和电导率的变化进行监测。

 

Highly efficient desalting in 30 s using HiTrap<sup>®</sup> Desalting

图2.4.使用HiTrap®脱盐柱在30秒内高效脱盐。

为避免交叉污染,仅能使用与样品类型相同的脱盐柱。

 

脱盐柱平衡

1.  用缓冲液填充注射器或泵管。取下塞子。将脱盐柱连接到注射器(通过连接器)或泵管上,为防止空气进入脱盐柱,连接过程中要始终保持有水存在。

2.  掰断脱盐柱出口处的可折断端。

3. 使用25 ml缓冲液以5 ml/min的速度清洗脱盐柱,以完全去除含有20%乙醇的储存缓冲液*。如果有空气滞留在脱盐柱中,应使用脱气缓冲液清洗至空气消失。在上样过程中意外引入柱中的空气不会影响分离。

* 使用HiTrap® 5 ml脱盐柱时,5 ml/min相当于约120滴/分钟。

 

使用注射器手动脱盐

1. 若使用注射器操作脱盐柱,应使用附带的连接器将注射器与脱盐柱相连。

2. 平衡脱盐柱,参见上一页的“脱盐柱平衡”。

3. 使用2-5 ml注射器以1-10 ml/min的流速加样。弃去从脱盐柱洗脱出的液体。如果样品体积小于1.5 ml,则更换为缓冲液并继续进样,直至所有1.5 ml均被洗脱出来。弃去洗脱出来的液体。

4. 使用合适的洗脱体积洗脱蛋白质,参见表2.9。收集脱盐的蛋白质。

 

当使用一个HiTrap® 5 ml脱盐柱时,建议的最大样品体积为1.5 ml,见表2.9。有关小样品体积应用的信息,参见表2.8。

 

表2.9. 使用HiTrap®脱盐柱和注射器的建议样品和洗脱体积,以及脱盐样品的典型得率和剩余盐含量实例

 

上样体积(ml) 缓冲液体积(ml) 洗脱和收集(ml) 得率(%) 剩余盐含量(%) 稀释系数  
0.25 1.25 1.0 > 95 0.0 4.0
0.50 1.0 1.5 > 95 < 0.1 3.0
1.00 0.5 2.0 > 95 < 0.2 2.0
1.50 0.0 2.0 > 95 < 0.2 1.3

 

脱盐柱的空隙体积为1.5 ml。高分子量组分在1.5-4.5 ml之间开始洗脱,具体取决于样品体积。低分子量组分在3.5 ml之后开始洗脱。

某些类型的分子,如小杂环或杂环芳香化合物(嘌呤、嘧啶、染料),可与Sephadex™发生相互作用,因此,其洗脱时间晚于预期。在这些情况下,可使用更大的样品体积,但必须针对每种类型的污染化合物优化分离过程。

 

使用泵脱盐

1.平衡脱盐柱:参见上一页的“脱盐柱平衡”。

2.加入1.5 ml样品。使用紫外监测器和/或电导率监测器监测脱盐柱流出物。保持流速在1-10 ml/min之间。收集组分。

3.在加入下一个样品之前,使用约10 ml缓冲液洗脱脱盐柱。收集组分。

在ÄKTAprime plus上使用HiTrap®脱盐柱自动脱盐

ÄKTAprime plus包含用于单个HiTrap® 脱盐柱和HiPrep™ 26/10脱盐柱的预编程模板。以下流程采用HiTrap® 5 ml脱盐柱。

 

缓冲液制备

平衡缓冲液(A1口):制备至少500 ml所需缓冲液。

应使用高纯度的水和化学试剂制备缓冲液。使用前,用0.45 µm过滤器过滤缓冲液。

 

样品制备

使用0.45 µm过滤器过滤样品。

建议的最大样品体积为1.5 ml。

 

准备ÄKTAprime plus

1.将A口(8通阀)和B口(2通阀)的进口管放到缓冲液中。

2.将三个棕色废液管放入废液瓶中。

3.将脱盐柱连接在注射阀(7通阀)1口和紫外流动池之间。

4.在组分收集器支架上装入18 mm收集管(最少20个),并将分离臂上的白板放在第一个收集管上

5.在注射阀的2口和6口之间连接一个足够大的上样环。使用注射器手动填充上样环。

注意:如果需要Superloop™,参见使用说明中的更多信息。输入样品体积并按OK按钮,启动模板。

 

 

系统准备完成后,剩余步骤(在“选择应用程序模板”项下并启动下述方法)将自动执行。

 

选择应用程序模板并启动方法

1. 检查与PrimeView™的连接。在屏幕右下角,应显示文字“Controlled By: prime ”。

2.使用箭头和OK按钮在菜单树中移动,找到“Desalting HiTrap® Desalting”。

 

HiTrap desalting

3. 输入样品体积并按OK按钮,启动模板。

图2.5 显示了使用HiTrap®脱盐柱和ÄKTAprime plus色谱系统对正常大小的球状蛋白进行脱盐的典型结果。预期在抗体的缓冲液置换中也将出现该图所示结果。利用紫外和电导率曲线,可将合适的脱盐组分合并。

 

Typical desalting of a normal sized globular protein

图2.5. 使用色谱系统对正常大小的球状蛋白进行脱盐的典型结果。

 

将脱盐规模从HiTrap® 放大至HiPrep™

为分离大于1.5 ml的样品体积,或为增加高分子量与低分子量成分之间的分离度,可轻松串联多达三个HiTrap®脱盐柱(参见表2.8)。对于注射器操作,表2.8中建议的体积应按比例增加,并保持建议流速。样品稀释取决于样品体积和脱盐柱串联数量。稀释因子可以低于表2.8中建议的数值,但是必须针对每种样品体积和脱盐柱串联数量组合对洗脱体积进行优化。当流速为10 ml/min时,每个脱盐柱的背压约为0.25 bar。

HiPrep™ 26/10脱盐柱采用Sephadex™ G-25 Fine填充。它能够对高分子量(Mr > 5 000)和低分子量物质(Mr < 1 000)进行分组分离,实现可靠、可重复的脱盐和缓冲液置换,每个脱盐柱可容纳15 ml的样品体积。可串联使用2-4个脱盐柱(表2.8),容纳30-60 ml的样品体积(图2.6)。

 

表2.6. 60 ml样品可以在四个串联的HiPrep™ 26/10脱盐柱中运行。

 

使用HiPrep™ 26/10脱盐柱和ÄKTAprime plus实现自动化缓冲液置换

缓冲液制备

平衡缓冲液(A1口):20 mM磷酸钠,150 mM氯化钠,pH 7.0。至少准备500 ml洗脱液。

 

样品制备

应使用高纯度的水和化学试剂制备缓冲液。使用前,用0.45 µm过滤器过滤缓冲液。

使用0.45 µm过滤器过滤样品。

建议的最大样品体积为15 ml。

1.将A口(8通阀)和B口(2通阀)的进口管放到缓冲液中。

2.将三个棕色废液管放入废液瓶中。

3.将脱盐柱连接在注射阀(7通阀)1口和紫外流动池之间。

4.在组分收集器支架上装入18 mm收集管(最少25个),并将分离臂上的白板放在第一个收集管上。

5.在注射阀的2口和6口之间连接一个足够大的上样环。使用注射器手动填充上样环。

注意:如果需要Superloop™,参见产品说明中的更多信息。

 

 

系统准备完成后,剩余步骤(在“选择应用程序模板”项下并启动下述方法)将自动执行。

 

选择应用程序模板并启动方法

1. 检查与PrimeView的连接。在屏幕右下角,应显示文字“Controlled By: prime ”。

2.使用箭头和OK按钮在菜单树中移动,找到“Desalting HiPrep™ Desalting”。

 

HiPrep Desalting

 

3. 输入样品体积并按OK按钮,启动模板。

A typical desalting of BSA using a chromatography system.

图2.7. 使用色谱系统对BSA进行脱盐的典型结果。

 

使用PD脱盐柱进行小规模脱盐和缓冲液置换

 

PD-10脱盐柱、PD MidiTrap™ G-25、PD MiniTrap™ G-25、PD SpinTrap™ G-25和PD MultiTrap™ G-25 脱盐柱以及96-孔过滤板采用Sephadex™ G-25介质填充,可通过脱盐和缓冲液置换对高分子量(Mr > 5 000)和低分子量物质(Mr < 1 000)实现分组分离。

PD产品解决了蛋白质样品或其他生物分子的灵活、小规模制备需求,使制备样品适用于凝胶电泳、液相色谱(LC)、液相色谱-质谱(LC-MS)和质谱(MS)等下游分析技术。这些脱盐柱和过滤板产品适用的样品体积范围为70 µl-2.5 ml,可支持平行处理多个样品。此外,PC-10脱盐柱、PD MidiTrap™ G-25和PD MiniTrap™ G-25经过优化可用于离心,从而无需对洗脱样品进行稀释。

 

PD SpinTrap™ G-25

PD SpinTrap G-25

图2.8. PD SpinTrap™ G-25是一次性脱盐柱,可用于对分子量大于5000的生物分子进行快速脱盐和缓冲液置换。

PD SpinTrap™ G-25是一次性纯化柱,可利用标准微量离心机对100-180 µl样品实现快速、高度可重复的脱盐和缓冲液置换(图2.2 A和2.8)。该脱盐柱提供了高度可重复的平行脱盐/缓冲液置换和蛋白质纯化,无需样品稀释。

每包PD SpinTrap™ G-25包含可供50次制备使用的预装脱盐柱和收集管。

 

缓冲液

平衡缓冲液:适用于应用

 

脱盐步骤

1. 通过涡旋使介质悬浮。使用塑料底盖拆卸工具拧开螺帽盖并取下底盖。

2.将脱盐柱放入合适体积的收集管中,并以800 × g离心1分钟以去除储存溶液。

3.加入400 µl平衡缓冲液进行平衡并以800 × g离心1分钟。弃去流出液并更换收集管。重复该步骤4次。

 

为了确保获得最佳结果,务必使用总共1.5 ml的平衡缓冲液平衡纯化柱,以完全去除储存溶液。

4.将用过的收集管更换为新的、干净的收集管,以便收集样品。

5. 将100-180 µl样品缓慢添加至预装柱中间。

6.以800 x g离心2分钟进行洗脱。

对于较大样品量的脱盐,应使用较大规模的PD纯化产品或HiTrap®和HiPrep™脱盐柱,参见表2.8。对于多样品脱盐,应使用PD MultiTrap™ G-25。

 

回收率取决于蛋白质或其他生物分子的类型。通常,回收率介于70%至90%之间。样品浓度可提高回收率。对于体积低于140 µl的样品,通过在样品被完全吸收至柱床中后添加40 µl平衡缓冲液,可提高回收率。

 

PD MultiTrap™ G-25

PD MultiTrap™ G-25

图2.9. PD MultiTrap™ G-25 96孔板可对分子量大于5000的生物分子实现快速、高度可重复的纯化。

PD MultiTrap™ G-25 96孔板专用于高通量脱盐、缓冲液置换和蛋白质纯化,具有较高的孔间和板间重现性(图2.9)。96孔板可实现方便、可重复的多样品平行处理(图2.10)。PD MultiTrap™ G-25可手动操作或使用机器人系统和离心机进行自动操作,对体积为70-130 μl的样品进行脱盐或缓冲液置换。

96孔板采用Sephadex™ G-25介质填充,这是一种SEC介质,可从分子量大于5000的生物分子中高效去除低分子量物质。

每包PD MultiTrap™ G-25包含4个预装96孔板,可对最多384个样品进行脱盐或缓冲液置换。方便的收集板(每包5个)可单独购买。

 

Removal of sodium chloride from BSA on a PD MultiTrap™ G-25 96-well plate

图2.10.使用PD MultiTrap™ G-25 96孔板去除BSA中的氯化钠具有高度可重复的结果。平均脱盐率为93%,孔间差异为1%(相对标准偏差)。

 

离心方案

缓冲液

平衡缓冲液:适用于应用

 

脱盐步骤

1.将96孔板上下轻轻摇动,使介质悬浮。取下上下密封盖并将板放在收集板上。

2. 以800 × g离心1分钟,以去除储存溶液。

3. 每孔加入300 µl平衡缓冲液进行平衡并以800 × g离心1分钟。弃去流出液并更换收集板。重复该步骤4次。

为了确保获得最佳结果,务必使用总共1.5 ml的平衡缓冲液平衡每个孔,以完全去除储存溶液。

4. 将用过的收集板更换为新的、干净的收集板,以便收集样品。

5. 将70-130 µl样品添加至预装孔中间。

6. 以800 x g离心2分钟进行洗脱。

 

对于较大样品量的脱盐,应使用较大规模的PD纯化产品或HiTrap®和HiPrep™脱盐柱,参见表2.8。

 

回收率取决于蛋白质或其他生物分子的类型。通常,回收率介于70%至90%之间。样品浓度可提高回收率。对于体积低于100 µl的样品,通过在样品被完全吸收至柱床中后添加30 µl平衡缓冲液,可提高回收率。

 

PD MiniTrap™ G-25

PD MiniTrap™ G-25

图2.11. PD MiniTrap™ G-25预装柱可从体积高达500 µl的样品中分离分子量大于5000的蛋白质。

 

PD MiniTrap™ G-25可实现便捷的脱盐和缓冲液置换,能够容纳体积为100-500 µl的蛋白质样品(图2.11)。该脱盐柱预先填充了Sephadex™ G-25介质,这是一种SEC介质,可从分子量大于5000的蛋白质中高效去除低分子量物质。这些脱盐柱具有更大的样品体积容量,是PD SpinTrap™ G-25脱盐柱的理想替代品。

为提高灵活性,该产品具有两种可替代应用方案,即依靠重力或离心。重力方案可平行净化多个样品,无需独立的纯化系统。离心方案采用标准离心机处理样品,所得洗脱样品具有最小的稀释度。

每包PD MiniTrap™ G-25包含离心方案所需的50个预装柱和4个适配器。

 

重力方案

缓冲液

平衡缓冲液:适用于应用

脱盐步骤

1.取下顶盖,倒掉脱盐柱储存溶液。取下底盖。

2.向脱盐柱中填充平衡缓冲液,使平衡缓冲液完全进入预装柱床。重复2次并弃去流出液。

为了确保获得最佳结果,务必使用总共8 ml的平衡缓冲液平衡脱盐柱,以完全去除储存溶液。

3.向脱盐柱中加入100-500 µl样品。对于体积低于500 µl的样品,应在样品完全进入预装柱床后加入平衡缓冲液,将体积调整至500 µl。

4.等待样品和平衡缓冲液完全进入预装柱床。弃去流出液。

5.将样品收集管放在脱盐柱下面,并洗脱1 ml缓冲液。收集脱盐样品。

对于较大样品量的脱盐,应使用HiTrap®和HiPrep™脱盐柱,参见表2.8。

回收率取决于蛋白质类型。通常,回收率介于70%至90%之间。样品浓度可提高回收率。重力流方案比离心方案具有更高的回收率和脱盐率。

 

图2.12显示了典型的蛋白质脱盐结果。尽管图中所示的脱盐蛋白质是BSA,但使用PD MiniTrap™ G-25完成的抗体脱盐预期也将产生相似的结果。

 

Removal of sodium chloride from BSA using the gravity protocol.

图2.12. 使用重力方案去除BSA中的氯化钠。蛋白质回收率为95%。

 

离心方案

缓冲液

平衡缓冲液:适用于应用

脱盐步骤

1. 取下顶盖,倒掉脱盐柱储存溶液。

2. 用镊子取下顶部过滤器。取下底盖。

3. 将PD MiniTrap™ G-25放入一个15 ml收集管中并将附带的脱盐柱适配器连接到收集管顶部。

4. 向脱盐柱中填充平衡缓冲液,使平衡缓冲液完全进入预装柱床。重复该步骤并弃去流出液。

5。再次向脱盐柱中填充平衡缓冲液,然后以1000 x g离心2分钟并弃去流出液。

为了确保获得最佳结果,务必使用总共8 ml(第4步和第5步)的平衡缓冲液平衡脱盐柱,以完全去除储存溶液。

6. 将200-500 µl样品缓慢添加至预装柱床中间

7. 将PD MiniTrap™ G-25放入一个新的15 ml收集管中。

8. 以1000 x g离心2分钟进行洗脱,收集洗脱物。

对于较大样品量的脱盐,应使用HiTrap®和HiPrep™脱盐柱,参见表2.8。

 

回收率取决于蛋白质类型。通常,回收率介于70%至90%之间。样品浓度可提高回收率。重力流方案比离心方案具有更高的回收率和脱盐率。



PD MidiTrap™ G-25

PD MidiTrap G-25

图2.13. PD MidiTrap™ G-25预装柱可从体积高达1 ml的样品中分离分子量大于5000的蛋白质。

 

图2.13. PD MidiTrap™ G-25预装柱可从体积高达1 ml的样品中分离分子量大于5000的蛋白质。

 

PD MidiTrap™ G-25可实现便捷的脱盐和缓冲液置换,能够容纳体积为0.5-1.0 ml的蛋白质样品(图2.13)。该脱盐柱预先填充了Sephadex™ G-25介质,这是一种SEC介质,可从分子量大于5000的蛋白质中高效去除低分子量物质。这些脱盐柱具有更大的样品体积容量,是PD MiniTrap™ G-25脱盐柱的理想替代品。

为提高灵活性,该产品具有两种可替代应用方案,即依靠重力或离心。重力方案可平行净化多个样品,无需独立的纯化系统。离心方案采用标准离心机处理样品,所得洗脱样品具有最小的稀释度。

每包PD MidiTrap™ G-25包含离心方案所需的50个预装柱和4个适配器。

 

离心方案

缓冲液

平衡缓冲液:适用于应用

脱盐步骤

1. 取下顶盖,倒掉脱盐柱储存溶液。

2. 用镊子取下顶部过滤器。取下底盖。

3. 将PD MidiTrap™ G-25放入一个50 ml收集管中并将附带的脱盐柱适配器连接到收集管顶部。

4. 向脱盐柱中填充平衡缓冲液,使平衡缓冲液完全进入预装柱床。重复该步骤并弃去流出液。

5. 再次向脱盐柱中填充平衡缓冲液,然后以1000 x g离心2分钟并弃去流出液。

为了确保获得最佳结果,务必使用总共15 ml(第4步和第5步)的平衡缓冲液平衡脱盐柱,以完全去除储存溶液。

6. 将0.75-1.0 ml样品缓慢添加至预装柱床中间。

7. 将PD MidiTrap™ G-25放入一个新的50 ml收集管中。

8. 以1000 x g离心2分钟进行洗脱,收集洗脱物。

 

对于较大样品量的脱盐,应使用HiTrap®和HiPrep™脱盐柱,参见表2.8。

 

回收率取决于蛋白质类型。通常,回收率介于70%至90%之间。样品浓度可提高回收率。重力流方案比离心方案具有更高的回收率和脱盐率。

 

一次性PD-10脱盐柱

PD-10脱盐柱可实现便捷的脱盐和缓冲液置换,能够容纳体积为1.0-2.5 ml的蛋白质样品。该脱盐柱预先填充了Sephadex™ G-25介质,这是一种SEC介质,可从分子量大于5000的蛋白质中高效去除低分子量物质。这些脱盐柱具有更大的样品体积容量,是PD MidiTrap™ G-25脱盐柱的理想替代品。

为提高灵活性,该产品具有两种可替代应用方案,即依靠重力或离心。重力方案可平行净化多个样品,无需独立的纯化系统。离心方案采用标准离心机处理样品,所得洗脱样品具有最小的稀释度。

每包PD-10脱盐柱包含30个预装柱。为简化PD-10脱盐柱的重力方案,可使用LabMate PD-10缓冲液储液器。利用这款缓冲液储液器,可在同一步中加入清洗和平衡缓冲液。

图2.14显示了典型的分离结果。尽管图中所示为典型的白蛋白脱盐,但抗体脱盐预期也将产生相似的结果。

 

Removal of sodium chloride from albumin solution.

图2.14. 去除白蛋白溶液中的氯化钠。使用蒸馏水平衡PD-10脱盐柱。将含有人血清白蛋白(25mg)的样品溶解于2.5 ml的500 mM氯化钠溶液中。在3.5 ml洗脱物中共回收了23.8 mg白蛋白,相应的回收率为95.3%(箭头之间)。脱盐前样品中起始的盐总量为2%。

 

重力方案


缓冲液

平衡缓冲液:适用于应用

 

脱盐步骤

1. 剪掉底部尖端,取下顶盖,倒掉多余的液体。

2. 如果条件允许,将LabMate缓冲液储液器安装在PD-10脱盐柱顶部,并将脱盐柱放在PD-10 Desalting Workmate上。

3.使用约25ml的缓冲液平衡脱盐柱。弃去流出液(可用塑料托盘收集流出液)。

为了确保获得最佳结果,务必使用总共25 ml的平衡缓冲液平衡脱盐柱,以完全去除储存溶液。

4.加入总体积为2.5 ml的样品。如果样品体积低于2.5 ml,则加入缓冲液直至总体积达到2.5 ml。弃去流出液。

5.用3.5 ml缓冲液洗脱并收集流出液。

对于较大样品量的脱盐,应使用HiTrap®和HiPrep™脱盐柱,参见表2.8。

回收率取决于蛋白质类型。通常,回收率介于70%至90%之间。样品浓度可提高回收率。重力流方案比离心方案具有更高的回收率和脱盐率。

 

 

离心方案

缓冲液

平衡缓冲液:适用于应用

 

脱盐步骤

1. 取下顶盖,倒掉脱盐柱储存溶液。

2.用镊子取下顶部过滤器。取下底盖。

3.将PD-10脱盐柱放入一个50 ml收集管中并将附带的脱盐柱适配器连接到收集管顶部。

4. 向脱盐柱中填充平衡缓冲液,使平衡缓冲液完全进入预装柱床。重复3次,每次均弃去流出液。

5. 再次向脱盐柱中填充平衡缓冲液,然后以1000 x g离心2分钟并丢弃流出液。

为了确保获得最佳结果,务必使用总共25 ml(第4步和第5步)的平衡缓冲液平衡脱盐柱,以完全去除储存溶液。

6. 将1.75-2.5 ml样品缓慢添加至预装柱床中间。

7.将PD-10脱盐柱放入一个新的50 ml收集管中。

8.以1000 x g离心2分钟进行洗脱,收集洗脱物。

 

对于较大样品量的脱盐,应使用HiTrap®和HiPrep™脱盐柱,参见表2.8。

回收率取决于蛋白质类型。通常,回收率介于70%至90%之间。样品浓度可提高回收率。重力流方案比离心方案具有更高的回收率和脱盐率。

 

材料