细胞外基质蛋白质和细胞培养优化工具


 摘要

动物细胞和组织培养技术被不断改进,以优化体外细胞培养条件。细胞外基质(ECM)蛋白质包被,即细胞培养容器的化学或物理修饰,已被证明是更好地模拟体内细胞行为的有效方法。我们在这里将描述可用的各种包被,以及一些新技术亮点。

背景:20世纪,动物组织在玻璃表面培养,但由于需要仔细的清洁程序,因此研究人员开始尝试用聚苯乙烯制成的一次性塑料培养容器1,2。然而,塑料培养容器有一定的局限性3

  • 在无血清培养基中,细胞难以生长和附着
  • 细胞形状、极性和形态变化
  • 增加细胞增殖,减少分化
  • 对激素和生长因子的反应性较低

然后研究人员开始用生物材料(生物包被)和合成聚合物(化学包被)来包被容器,这些材料可以增强细胞的附着、生长和分化。与在平坦的2D塑料表面上生长的细胞不同,包被表面上的细胞生长更接近自然环境。该技术可以被认为是生理2D环境或2.5D细胞培养条件。
 

 
与在平坦的2D塑料表面上生长的细胞不同,包被表面上的细胞生长更接近自然环境

 

在生物(细胞外基质蛋白)或化学(聚赖氨酸......)包被存在下培养的细胞,比在传统的2D细胞培养条件下培养的细胞,经历更多的生理学相关行为。


 细胞外基质的组分

组织不仅只是紧紧堆积在一起的细胞,而是其大部分体积包含细胞外空间,并且充满了称为细胞外基质(ECM)的复杂的蛋白质网状结构。大多数组织中ECM的组分由成纤维细胞分泌,分为蛋白多糖和纤维蛋白(胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白)4。这些组分提供结构支持并促进细胞的通信。整合素是细胞表面上的跨膜蛋白,它将细胞的细胞骨架连接到ECM,激活调节细胞增殖、形态、粘附和细胞死亡的信号通路。 

胶原蛋白

胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质,占总蛋白质量的25%。它由三条多肽链(称为α链)组成,以螺旋构象排列,富含甘氨酸和脯氨酸残基。有20多种不同类型的胶原蛋白,其中胶原蛋白 I、II、III、V 和 XI 是通常在结缔组织中发现的纤维状胶原蛋白。胶原蛋白 IX 和 XII 是原纤维相关的胶原蛋白,其将原纤维彼此连接,并连接到细胞外基质的组分。而 IV 型和 VII 型胶原蛋白是构成网络的胶原蛋白,构成基底层的主要部分5

在组织中,胶原蛋白提供结构支持、强度和弹性,在细胞培养中,它用于研究细胞的生长、分化和迁移6

 

名称 货号 所使用的细胞系 研究领域
I 型胶原蛋白 C9791C7661
C1809
C2249
C2124
成肌细胞,脊神经节,肝细胞,胚肺,心脏外植体,成纤维细胞,内皮细胞和胰岛细胞 基础研究,血管生成,神经生物学,内分泌学
II 型胶原蛋白 C9301 软骨细胞,上皮细胞 基础研究
IV 型胶原蛋白 C0543C5533 上皮细胞,内皮细胞,肌肉细胞和神经细胞 基础研究,血管生成,神经生物学


有胶原蛋白供应,并随附所使用的细胞系和研究领域信息

弹性蛋白

弹性蛋白是750种氨基酸的疏水蛋白,富含脯氨酸和甘氨酸。然而,与胶原蛋白不同,这些氨基酸残基不是糖基化的。原弹性蛋白,一种分泌到细胞外空间的可溶性前体,组装成不溶性弹性纤维和片。弹性纤维提供所需的弹性,使组织在短暂拉伸后可以回缩5
 

名称 货号 所使用的细胞系 研究领域
弹性蛋白 E1625E6527 上皮细胞,内皮细胞和心肌细胞 癌症研究,血管生成,再生医学


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纤连蛋白

纤连蛋白是一种大的糖蛋白(220 kDa),由两条多肽链(二聚体)组成,多肽链的一端连接有二硫键。每个多肽进一步折叠成功能和结构上不同的结构域,其结合ECM的各种组分(糖胺多糖、蛋白多糖和胶原蛋白)以及细胞表面蛋白。纤连蛋白由多种结缔组织细胞分泌,包括:成纤维细胞、软骨细胞、雪旺细胞、巨噬细胞、肠上皮细胞和肝细胞7

纤连蛋白是参与细胞粘附和扩散的多功能蛋白质。它还调节细胞形态、细胞迁移、细胞骨架组织、止血和伤口修复。
 

名称 货号 所使用的细胞系 研究领域
纤连蛋白 F1141F0635F2518,F0895
F4759
F2006
上皮细胞、间质细胞、神经元细胞、成纤维细胞和内皮细胞 癌症研究,再生医学和内分泌学

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层粘连蛋白

层粘连蛋白是基底层的主要成分。它由三条长的多肽链(称为α、β和γ)组成,这些多肽链通过二硫键连接在一起,并以不对称的十字形排列。层粘连蛋白起胶水作用,将细胞和ECM保持在一起。它具有胶原蛋白结合、细胞粘附、肝素结合和神经突向外生长片段的活性结构域。层粘连蛋白调节细胞生长、运动性和信号通路3,8

 

名称 货号 所使用的细胞系 研究领域
层粘连蛋白 L6274L2020
L4544
上皮细胞,内皮细胞,肌肉细胞,神经鞘瘤,肿瘤细胞,肝细胞 癌症研究,再生医学,宿主病原体相互作用研究,神经生物学和内分泌学

有层粘连蛋白供应,并随附所使用的细胞系和研究领域信息

 

玻连蛋白

玻连蛋白是459种氨基酸的糖蛋白,存在于ECM和血液中。它以75 kDa的单链基团形式或以65 kDa和10 kDa双链基团形式在血液中循环。玻连蛋白与多糖(糖胺多糖)和蛋白多糖相互作用,充当细胞粘附分子。虽然玻连蛋白和纤连蛋白具有相似的功能,并具有Arg-Gly-Asp细胞识别序列,但它们在结构和免疫学上是不同的9

玻连蛋白作为细胞溶解补体途径的抑制剂,具有凝血途径的生理作用。此外,它还促进内皮细胞和肿瘤细胞的细胞迁移、增殖、分化和扩散。

 

名称 货号 所使用的细胞系 研究领域
玻连蛋白 V0132V9881
V8379
08-126, 
SRP3186
血小板,内皮细胞,干细胞,黑色素瘤和骨肉瘤 癌症研究,血管生成,再生医学,凝血研究


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描述 货号
ECM细胞培养优化阵列(比色,96孔) ECM541

 

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描述 货号
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Millicoat™人玻连蛋白包被联排(96孔) ECM102
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Millicoat™人 I 型胶原蛋白包被联排(96孔) ECM104
Millicoat™人 IV 型胶原蛋白包被联排(96孔) ECM105
Millicoat™ECM筛选试剂盒,每包1个 ECM101-ECM105 ECM205

 

ECM肽

细胞外基质成分为细胞功能提供生化和物理提示。目前的技术仅为细胞附着等简单的细胞过程提供了足够的环境。但最近的一项研究表明,这些细胞外基质衍生肽在表面的组合可以提高细胞增殖率、细胞粘附强度和粘着斑组装10Kollodis BioSciences’ MAPTrix™ 技术通过结合组合肽基序来诱导和/或调节组合整合素介导的信号传导过程,从而提供真正的ECM微环境。Kollodis ECM文库提供了一种调节多种细胞表面受体的方法,该技术将传统的ECM肽替换为在贻贝粘附蛋白以基因方法掺入的肽,使细胞保持在无血清和饲养层的条件下。


 化学 / 合成包被

聚赖氨酸和聚鸟氨酸

合成聚合物(聚氨基酸)包被促进细胞和蛋白质的附着。聚赖氨酸和聚鸟氨酸等聚氨基酸在聚苯乙烯上产生正电荷,并增加可用于细胞结合的带正电荷的位点11。它们还与附着因子组合使用,所述附着因子可以加强细胞膜的负离子和培养物表面附着因子的正离子间的静电相互作用。

 

名称 货号 所使用的细胞系 研究领域
聚赖氨酸 P4707P4832P7280,P9155P6407P6282P7405P5899 原代神经元,胶质细胞,神经母细胞瘤,转染细胞系,成纤维细胞和上皮细胞 基础研究,癌症研究和神经生物学
聚-L-鸟氨酸 P4957 原代神经元,胶质细胞,神经母细胞瘤,转染细胞系,成纤维细胞和上皮细胞 基础研究,癌症研究和神经生物学

用于化学包被的产品,随附所使用的细胞系和研究领域信息


Cytosoft包被

基底的刚性影响细胞功能。CytoSoft®板涂有很薄的一层生物相容的硅胶,其具有多种刚性,可覆盖广泛的生理学范围。凝胶表面形成与蛋白质稳定相连的共价键,促进凝胶包被附着因子(ECM组分)和细胞接种。以下是CytoSoft® 板的优点:

  • 透光性好,自发荧光低
  • 硅凝胶不易水解
  • 硅凝胶稳定,不会干燥或膨胀
  • 抗撕裂或开裂
  • 在长期储存期间刚性几乎没有变化
  • 胰蛋白酶和胶原蛋白酶可用于收获细胞
  • 酶处理后抗生化分解


 结论

用ECM蛋白和合成聚合物包被培养表面后极大地影响细胞行为。观察到的响应取决于细胞类型和用作底物的包被。与附着因子接触的细胞存活时间更长,并且还可以在不含血清因子的情况下生长3。附着因子可以隔离和储存生长因子,从而控制因子的时空调节,并促进生长因子受体与ECM受体之间的相互传导。它还定义机械特性,并指示细胞在允许条件下进行分化。ECM蛋白还通过细胞表面受体与生长因子信号传导协同诱导细胞内信号传导12。随着细胞培养技术的发展,需要更多的组分和组合来更好地模拟组织的体内条件,并破译细胞之间细胞外基质的语言。


 材料

     

 参考文献

  1. Curtis, A. S., Forrester, J. V., McInnes, C., and Lawrie, F. (1983) Adhesion of cells to polystyrene surfaces. J. Cell Biol. 97, 1500–1506.
  2. Amstein, C. F., and Hartman, P. A. (1975) Adaptation of plastic surfaces for tissue culture by glow discharge. J. Clin. Microbiol. 2, 46–54.
  3. Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., and Sephel, G. C. (1987) Use of extracellular matrix components for cell culture. Anal. Biochem. 166, 1–13.
  4. Lodish, H. (Ed.). (2002) Molecular cell biology 4. ed., [Nachdr.]. Freeman, New York, NY.
  5. Alberts, B. (Ed.). (2002) Molecular biology of the cell 4. ed. Garland Science, New York, NY.
  6. Kleinman, H. K., Klebe, R. J., and Martin, G. R. (1981) Role of collagenous matrices in the adhesion and growth of cells. J. Cell Biol. 88, 473–485.
  7. (2012) Mammalian Cell Culture The Use of Serum-free Hormone-supplemented Media. Springer Verlag.
  8. Gamm, D. M., Melvan, J. N., Shearer, R. L., Pinilla, I., Sabat, G., Svendsen, C. N., and Wright, L. S. (2008) A novel serum-free method for culturing human prenatal retinal pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 788–799.
  9. Preissner, K. T. (1991) Structure and biological role of vitronectin. Annu. Rev. Cell Biol. 7, 275–310.
  10. Reyes, C. D., Petrie, T. A., and García, A. J. (2008) Mixed extracellular matrix ligands synergistically modulate integrin adhesion and signaling. J. Cell. Physiol. 217, 450–458.
  11. Mazia, D., Schatten, G., and Sale, W. (1975) Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. J. Cell Biol. 66, 198–200.
  12. Rozario, T., and DeSimone, D. W. (2010) The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev. Biol. 341, 126–140.