黑洞淬灭剂(Black Hole Quencher®

两种常用的淬灭剂TAMRA™和DABYCL限制了qPCR的最终灵敏度和灵活性。TAMRA不是暗淬灭剂,因此由于其自身的天然荧光而造成背景总体增加。DABCYL虽然是一种暗淬灭剂,但其吸收足迹不足,与480 nm以上发射的报告染料重叠很差(图1)。

 

DABCYL-T9的吸收光谱

 

图1. DABCYL-T9的吸收光谱与常用报告染料6-FAM™、TET™和JOE™的发射光谱。DABCYL在聚-T吸光度(260 nm)处标准化。RFU = 相对荧光单位。

虽然DABYCL在Molecular Beacons(结构化探针,含有配对报告染料和基于静态淬灭的淬灭剂)中很有效,但其474 nm的最大吸收低于图1所示报告染料的最大值,因此对于双标记探针(含有单独报告染料和基于FRET淬灭的淬灭剂的线性探针)来说它不是一个好的选择。

黑洞淬灭剂1(BHQ®-1)(具有534 nm吸收最大值)在比DABCYL更高的波长下被吸收,可直接与FAM、TET和JOE的发射最大值重叠。这使静态和FRET淬灭效率显著增加,从而使其成为Molecular Beacons和双标记探针的优异淬灭剂。如图2所示,BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3覆盖从480 nm到近红外的光谱,因此可以使用在该范围内任何地方发射的报告染料。

 

三种BHQ变体的吸收光谱

 

图2. 三种BHQ变体(与T-9缀合,并按260 nm的聚-T吸光度标准化)的吸收光谱,以及常用报告染料6-FAM、TET、HEX™、青色素3、TAMRA、ROX™、LC红640和青色素5的发射最大值。

与相应的DABCYL或TAMRA探针相比,除了具有较好的光谱重叠外,BHQ探针还具有高得多的信噪比(图3)。

 

信噪比(S:N)

 

图3. 在存在5倍过量的精确互补的靶序列的情况下,将25聚体的荧光信号除以探针单独的荧光强度,所得结果即为信噪比(S:N)。

最后,如图4所示,BHQ变体允许单管多重测定,因为报告染料种类增加,所以可以有效地淬灭,却很少存在或完全不存在串扰。这简化了多重测定的设计、实施和解释。 

 

BHQ变体的独特性允许灵活选择光谱良好分辨的报告染料

 

图4. BHQ变体的独特性允许灵活选择光谱良好分辨的报告染料,这在单管多重测定中很少或没有串扰。

总之,黑洞淬灭剂:

  1. 没有天然荧光(发热而不是发光),因此背景荧光较低
  2. 增加了信噪比,具有更高的灵敏度
  3. 使更多的报告染料能够用于多重测定


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