用 BRAND® PCR 板确定抗体特征

作者:AG Arndt/ Krauss
Nationales Centrum für Tumorerkrankungen (NCT) Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 460, 69120 Heidelberg
 

 引言

在抗体技术领域,生成可以用来进行个性化治疗干预的具有独特功能特性的全人抗体仍然是一个巨大挑战。然而,可以从人类 B 细胞中把与特异性抗原结合的这些抗体分离出来。

在这项研究中,从头颈癌症患者的淋巴结的 B 细胞库克隆了各种 igG 抗体基因。对淋巴结抗体的序列分析显示了重新排序的抗体自然出现的分布图,代表了所有已知的各种基因族,以及功能最强的微生物系序列。

为了论证从细胞库中选择具有治疗潜力之抗体的可行性,测试了这些抗体对 HSV-1(单纯疱疹病毒)感染细胞的靶向抗原的亲和性。

大多数 scFv(单链抗体可变区片段,单链病毒)抗体片段借助纳摩尔亲和性与 HSV 株的靶向抗原结合。

 

 材料及方法1

为了分离抗体,使用了来自头颈癌患者淋巴节的 IgG 捐献库。因此可以产生轻链和重链(VH/ VL-kappa and VH/ VL-lambda)的各种区域的独立基因池。被这些基因转变的细菌性细胞在琼脂板上培养生长一夜。这些被转变和培养的大肠杆菌细胞在下一步被储存在 -80 °C 的等份甘油中。

选择了经转变的等份示范样品,并在晃动的烧瓶中培养,然而将这些稀释十倍的大肠杆菌细胞转移到琼脂板上。取用每个板含有 8 个克隆的琼脂板,并进一步用 PCR 菌落分析,以阐明重链和轻链两者的基因是否整合在一起(片段大小 ~ 1 kb)。

 

表1:PCR 计划的特性
 

PCR 计划 时间
初始改性 95 °C 5 min
改性 95 °C 15 sec --------I
退火 51 °C 15 sec I 35 个循环

拉长 72 °C

15 sec --------I

最后拉长 72 °C

10 min
冷却 4 °C 无限

 

表 2:PCR 混合
 

  容量

KAPA 2 G 快速就绪混合(缓冲液、聚合酶、dNtPs、凝胶载样染剂)

12.5 μl

底物 A

0.5 μl

底物 B

0.5 μl

模板

选取的单个菌落
H2O 11.5 μl
总容量 25.0 μl

为了看到 scFV 在选定的菌落中的表达,需要对 PCR 使用琼脂糖凝胶电泳。

 结果

所有 8 个克隆(一式三份)均在 ~ 1 kb 片段尺寸显示了条带。因此,它们包括重链基因和轻链基因。

DNA 标记(位置1;14 和 27 的 NEB 的 100bp DNA Ladder (N3231)

图 1:[右]:DNA 标记(位置1;14 和 27 的 NEB 的 100bp DNA Ladder (N3231)。1.5% 琼脂糖凝胶在 140 V 运行 40 分钟)以及标记描述;[左]:琼脂糖凝胶(每个一式三份)

随后,被分离的 B 细胞片段用 HSV-1 感染细胞孵化。基于流式细胞仪亲和性测量,确定了 scFv 与 HSV-1 感染细胞的靶向抗原的结合平衡常数 (KD)。KD 值在纳摩尔范围内,表明了高度结合亲和性。
 

 讨论

BRAND® PCR 板(货号:7813 75)特别适用于菌落 PCR。平滑的孔表面最大程度减少了反应物在孔表面上的附着,因此 PCR 反应可以完全进行。这种 PCR 板所用的优质聚丙烯材料不含可能会减少产量的 PCR 抑制剂。除此之外,这些 PCR 板用最好的安装密封垫(货号:7814 05)密封,从而将蒸发损失隆至最低。

由于上述优点,所有被转变的克隆的抗体片段,可以大产出率再现,并用琼脂凝胶验证。

 参考文献

1 Philipp Diebolder, Armin Keller, Stephanie Haase, Anne Schlegelmilch, Jonathan D Kiefer, Tamana Karimi, Tobias Weber, Gerhard Moldenhauer, Roland Kehm, Anna M Eis-Hübinger, Dirk Jäger, Phillippe A Ferderspil, Christel Herold-Mende, Gerhard Dyckhoff, Roland E Kontermann, Michaela AE Arndt, and Jürgen Krauss.

Generation of „LYmph Node Derived Antibody Libraries“ (LYNDAL) for selecting fully human antibody fragments with therapeutic potential.

mAbs 6:1, 130-142; January/ February 2014; ©2014 Landes Bioscience
 


材料