用 BRANDplate® 嵌套板系统进行全厚度皮肤等同物的重建

作者:Lena Schober 和 Andrea Traube

Fraunhofer Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung IPA, Nobelstraße 12, 70569 Stuttgart, Germany

 引言

继欧洲立法尽可能限制动物实验之后,过去 10 年兴起了新的细胞和组织培养技术。特别是,在重建的人类全厚度皮肤和上皮等同物的应用中,随着基于细胞培养嵌套板的培养条件的改善,促成这些组织模型的成功商业化,例如 EpiDerm™ 和 EpiDerm™ (马萨诸塞州阿什兰 FT MatTek)、EpiSkin™ 和 EpiSkin™ FTM(法国里昂 SkinEthic)或 Phenion FT(德国杜塞尔多夫 Henkel)。如今,这些人类组织模型已经引入到药品与化妆品日常的耐受性、毒性与应激测试中。尽管在媒质合成和补充方面取得了进展,但器官培养的建立和操作仍需要投入大量时间和专业人员。

迄今为止,在培养工艺中亲身实践的时间增加了,人为偏差也增加了,可能会防碍人类组织高通量重建的成功。为了消除造成意外的工艺波动的根源,确保体外组织的质量和再现性,Fraunhofer Society 和 BRAND GMBH + CO KG 合作开发了 BRANDplates® 嵌入系统。该 24 孔平台专门设计用来满足对全自动操作基于嵌板的组织培养的所有需求。承载板的设计有 24 孔板和特殊的 6 孔板,均根据 ANSI/SLAS 标准 1 和 4 的要求设计(图 a 和 b)。相应的 BRANDplates® 小室联排每排有 4 个内嵌小室(图 c),在自动操作的任何时候都能被固定到位。

6 孔板:

  • 每个培养孔中只使用一到两个内嵌小室,以延长更换培养基的时间间隔。
  • 培养孔中一次最多可以更换 4 个内嵌小室中的培养基(图 b,第 3 页)。

Inlet 开口系统 (IOS)

  • 在细胞接种或初始涂敷的过程中无泄漏。
  • 可同时更换培养孔和内嵌小室里的培养基。
  • 只用一个步骤即可建立气-液界面。
  • 适用于 24 孔和 6 孔 BRANDplates®

内嵌小室:

  • 分开的 BRANDplates® 小室联排,方便后续分析。


不同培养阶段所需的容量

 

  24 孔 6 孔
内嵌小室(例如涂敷、细胞接种) 50 - 400 μl 50 - 400 μl
培养孔:浸入培养 1.6 - 2 ml 8 - 10 ml
培养孔:气-液界面(湿膜) 0.8 ml - 3.5 ml  

 

BRANDplates<sup>®</sup> 嵌套板小室配有 Inlet 开口系统

BRANDplates® 嵌套板小室配有 Inlet 开口系统(正在申请专利,图 c,第  3 页),专门用来支持自动化的人类皮肤体外重建。这一无与伦比的特点完美连接了培养孔与内嵌小室的培养基,移液管尖不需进入内嵌小室即可建立气-液界面。除了提高了培养的安全性,IOS 还减少了在两个腔室内更换培养基所需的移液步骤。这个用户手册简要介绍了全厚度皮肤等同物的重建,并给出了操作 BRANDplates® 内嵌小室系统的贴士。

 

I. 全厚度皮肤等同物的皮肤成分的制备

根据 Promocell 制定的实验方案

1.  原代成纤维细胞的传代

 原代成纤维细胞的传代

2. 胶原蛋白 I 型成纤维细胞混合物的制备

胶原蛋白 I 型成纤维细胞混合物的制备

3. 建立成纤维细胞 — 胶原蛋白浸入培养

建立成纤维细胞 — 胶原蛋白浸入培养

> 400 μl 每种皮肤等同物都需要胶原蛋白-成纤维细胞混合物。

建议:预留 30 % 的体积余量,以补偿移液误差!

> 4.0 x 104 成纤维细胞 /400 μl

> 5.2 x 104 成纤维细胞 /520 μl

520 μl 总量

其中 347 μl 胶原

其中 173 μl 凝胶中和培养基

凝胶中和培养基含有:

1. 25 μl/ml 4-硫酸软骨素(凝胶交联剂)

2. 25 μl/ml 6-硫酸软骨素(凝胶交联剂)

3. 2 x DMEM

4. 90 mM HEPES

5. 3 % FCS

> 建议使用的 I 型胶原蛋白浓度:

   6 mg/ml.

> 在冰上制备胶原蛋白混合物可以防止过早胶凝。

> 混合胶原蛋白时使用冰冷的移液管。

> 避免气泡!

> I 型胶原蛋白通常溶解于醋酸 (0.1 M, pH 3) 中,而且在添加细胞之前需要滴定 NaOH 加以中和。

> 或者使用含有 HEPES 和/或碳酸氢钠的培养基

> 使用具有 8 μm 孔径薄膜的内嵌小室!

使用具有 Inlet 开口系统 (IOS) 的 BRANDplates® 嵌套板

> 可以防止添加 / 改变培养基的过程中破坏培养

> 添加 / 改变培养基所需的移液步骤减少。

> 可在侧面对胶原蛋白嵌入成纤维细胞补充营养。

BRANDplates® 浸入培养的容量:

> 24 孔:2 ml

> 6 孔:10 ml

 

II. 胶原蛋白嵌入成纤维细胞与角质细胞的共培养

4. 用纤连蛋白涂敷皮肤等同物

用纤连蛋白涂敷皮肤等同物

5. 原代角质细胞的传代

原代角质细胞的传代

 

角质细胞的分裂:

1. 去除培养基。

2. 用预热的 PBS/EDTA 冲洗培养物。

3. 添加 PBS/EDTA,在 37°C,5 % CO2 温育 10 分钟。

4. 添加 0.025 % 胰蛋白酶/EDTA,在 37°C,5 % CO2 温育 5 分钟。

- T 25 瓶:2 ml

- T 75 瓶:4 ml

- T175 瓶:8 ml

5. 用 KBM + 10 % FCS 停止胰蛋白酶的消化。

6. 将角质细胞转移到离心管中。

 

6. 在皮肤等同物的上表面接种角质细胞

在皮肤等同物的上表面接种角质细胞

0 - 7 DIV

> 培养皮肤等同物 5-7 DIV。

> 每两天换一次培养基。

> 将 FCS 浓度从 10 % 逐步降低到 5 %。

在纤链蛋白温育期间

> KBM:角质细胞基础培养基

当胰蛋白酶化不足时:

> 添加建议体积的胰蛋白酶/EDTA,在 37°C 温育 2-3 分钟

> 小心地去除培养物的溶液,重新添加胰蛋白酶/EDTA,然后在 37°C 再温育 5 分钟。

> 角质细胞可能会对胰蛋白酶有知觉反应。请勿将角质细胞暴露于胰蛋白酶超过 10 分钟。

> 在显微镜下检查细胞是否开始分离!

> 胰蛋白酶的最大活动出现在 37°C 和 pH 7.6-7.8 条件下。

> 确保培养瓶密封紧密,以防温育箱中 pH 值因 CO2 而降低。

纤连蛋白涂敷后

> 纤连蛋白与角质细胞共培养 6 至 7 DIV。每两天换一次培养基。

> 将 FCS 浓度从 5 % 逐步降低到 0。

KGM:角质细胞生长培养基

> KBM 最终浓度

+ 牛脑垂体提取液 0.4 % v/v

+ 胰岛素(人重组)5.0 μg/ml

+ 氢化可的松 330 ng/ml

+ 上皮生长因子(人重组)125 ng/ml

+ 肾上腺素 390 ng/ml

+ 转铁蛋白,含铁(人)10 μg/ml

+ CaCl2 0.06 mM

+ 1 % 庆大霉素(根据德国海德堡 KGM2、PromoCell)
 

III. 悬空培养

7. 角质细胞的增殖和层化

角质细胞的增殖和层化

8. 全厚皮肤等同物的组织学特征

全厚皮肤等同物的组织学特征

8 - 19 DIV

悬空培养基:

> KGM,补充有:

+ 重组人胰岛素

+ 氢化可的松

+ 转铁蛋白,含铁(人)

+ 肾上腺素

+ 1.88 mM CaCl2

角质细胞增殖和分化的一些众所周知的标记物:

角蛋白 5 (K5)/ 角蛋白 14 (K14):

建立异二聚体,常见中间纤维的子单位,增殖标记物,通常由基底层的角质细胞表达(Poumay et al., 2004)

角蛋白 1 (K1)/ 角蛋白 10 (K10):

建立异二聚体,常见中间纤维的子单位,早期分化标记物,通常由棘层的角质细胞表达(Poumay et al., 2004)

内披蛋白:

位于棘层和角质层 内披蛋白是角化细胞角质化包膜的组成部分。

丝聚合蛋白:

角质层末期分化标记物,表现为粒层中的丝聚合蛋白原,是皮肤屏障功能的重要物质(Sandiland A et al., 2009)。

兜甲蛋白:

在粒层中表达,沉积于浆膜之下。兜甲蛋白通过转谷氨酰胺酶-1 与内披蛋白、repetin蛋白、S100 蛋白等其他蛋白交联,是角质化包膜的组成部分(Steinert PM et al., 1995)。
 

 总结

与普通的细胞培养嵌套板相比,BRANDplates® 嵌套板系统的应用具有许多优势。特殊的 6 孔板采用了独特的联体 24 孔设计,保证了在整个培养过程中培养孔与内嵌小室对中。内嵌小室和板子的几何设计定义了所谓的给液口。这个额外的凹穴方便了对培养孔的操作,无需移动或转动内嵌小室,避免了对培养的干扰。内嵌小室和给液口的特定位置,有助于确定集成在自动化流程中的给液器或吸液器的位置。这些特点,使 BRANDplates® 嵌套板系统成为可以完全由机器人操作细胞培养的唯一一种 24 孔嵌套培养板。

当 6 孔板与具有 Inlet 开口系统 (IOS)(正在申请专利)的 BRANDplates® 嵌套板结合使用时,所述的 6 孔板特性甚至会带来更多好处。培养孔与内嵌小室的培养基通过 IOS 互连,因此可以同时控制两个腔室里培养基的液位,在更换培养基的过程中,或者当需要建立气-液界面时,只需 6 个而不是 48 个移液步骤。4 个内嵌小室相连形成一个小室联排,也具有相当的优势。每当需要移动内嵌小室时,只需抓住一个联排,即可一次同时移动 4 个内嵌小室,例如在固定、脱水、清洗或染色过程中,将内嵌小室从一个培养孔转移到别一个培养孔。

BRANDplates<sup>®</sup> 嵌套板系统的应用具有许多优势

 订购信息

BRANDplates® 内嵌小室联排

内嵌小室联排,光滑内壁,或者具有 inlet 通道(Inlet 开口系统*)PS. cellGrade™ plus 表面,无菌 含有 4 个内嵌小室的联排(可拆分)
 

描述 孔径 μm 包装数量 PC 膜货号 PET 膜货号
光滑内壁 8.0 12(独立包装) 7828 60 7828 70
具有 Inlet 开口系统 8.0 12(独立包装) 7828 61 7828 71

 

 BRANDplates® 嵌套板系统

6 孔板,装有 6 个小室联排 PS. cellGrade™ plus 表面,无菌 内嵌小室联排,光滑内壁,或者具有 inlet 通道(Inlet 开口系统*) 带有有冷凝环的盖子
 

描述 孔径 μm 有盖板子的包装数量 PC 膜货号 PET 膜货号
光滑内壁 8.0 5(30 个小室联排) 7828 62 7828 72
具有 Inlet 开口系统 8.0 5(30 个小室联排) 7828 63 7828 63

* 正在申请专利

BRANDplates®、BIO-CERT® 和 BRAND® 是德国 BRAND GMBH + CO KG 的商标。

其他品牌是它们相应的所有者的财产。

我们的技术文献旨在向我们的客户提供信息和建议。然而,对于具体的应用,一般经验数据是否有效,在测试条件下所获得结果是否有效,取决于许多超出我们控制范围的因素。因此,我们希望不会因为我们的建议而承担任何赔偿责任。用户有责任检查产品对于具体应用的适用性。

如有任何技术更改,恕不另行通知。有可能存在错误。
 


材料