SygRNA® — 用于基因组编辑的合成crRNA和tracrRNA

 背景

CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)系统在细菌中被发现,其功能很像免疫系统,可以抵御入侵的病毒和质粒DNA。来自入侵病毒的短DNA序列(间隔区)被掺入细菌基因组内的CRISPR基因座,并充当先前感染的“记忆”。再次感染会触发互补的成熟CRISPR RNA(crRNA)以找到匹配的病毒序列。同时,crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)指导CRISPR相关(Cas)核酸酶切割“外源”DNA序列中的双链断裂。

II 型原核生物CRISPR“免疫系统”已被设计为用作RNA指导的哺乳动物基因组编辑工具,其能够简单、容易、快速地实施。当与Cas9蛋白结合时,SygRNA®(合成的crRNA和tracrRNA)形成靶向特定基因组基因座的核糖核蛋白(RNP)复合物。

直接引入Cas9 RNP,通过消除质粒DNA整合到宿主基因组中的可能性,加强并扩展了CRISPR基因组修饰技术的应用。在初始报告中,与用Cas9质粒转染的细胞相比,Cas9:sgRNA RNP导致的有效基因组修饰具有更高的特异性(Juris等人,2015,Kim等人,2014,Lin等人,2015,Liang等人,2015)。此外,Cas9 RNP技术为治疗应用带来了巨大希望,包括最近成功生成敲入原代人类T细胞(Schumann等人,2015)。

 

Cas9蛋白质, crRNA, tracrRNA

图1. 三组分 II 型CRISPR / Cas9:

  • Cas9蛋白质
  • crRNA
  • tracrRNA

 实验方案

 一般考虑因素

我们建议使用您首选的方法将核酸引入您感兴趣的细胞。Sigma-Aldrich提供各种转染试剂、细胞培养基和培养板、以及用于检测CRISPR介导的基因组编辑的定制DNA引物。我们在下面建议了一些实验方案供您参考。

建议

  • 在使用前立即将SygRNA®:Cas9蛋白质复合物(RNP)组装在冰上。
  • 在所有情况下,组合等摩尔量的crRNA:tracrRNA。
  • 对于使用转染试剂转染RNP的情况,使用crRNA:tracrRNA:Cas9蛋白质的1:1:1至5:5:1的比例制备RNP。
  • 对于RNP的核转染,使用crRNA:tracrRNA:Cas9蛋白质的1:1:1至5:5:2 的比例制备RNP。

一般而言,成功将Cas9 RNP导入培养细胞和原代细胞所需的步骤是:

  1. 制备SygRNA® crRNA和tracrRNA试剂。
  2. 准备细胞。
  3. 组装Cas9 RNP。
  4. 用RNP转染细胞。
  5. 收获和测定细胞。

SygRNA®Cas9蛋白质的制备和储存

SygRNA®重悬 — 将干燥的SygRNA® crRNA和tracrRNA分别重悬于含有10 mM Tris、PH为7至8的缓冲液*中,使浓度为20 μM(每微升20皮摩尔)。
 

crRNA或tracrRNA的量

 

Tris缓冲液的体积,20 μM最终原液
每种2 nmol

 

100 µl
每种5 nmol 250 µl


* 例如,将1 ml 1 M Trizma盐酸盐溶液(产品编号:T2663)与99 ml 无核酸酶的水(产品编号:W4502)混合(1:100稀释),制成10 mM溶液。

SygRNA® 的储存 — 将SygRNA®原液储存于-20°C非无霜冰箱中,避免多次冻融。长期保存则存储于-70°C下。

Cas9蛋白质重悬

  1. 根据下表用所提供的50%甘油溶液重悬冻干的Cas9蛋白质,最终达到5 mg/ml(30 pmol/μl)的浓度。
  2. 如果需要较低浓度的Cas9蛋白质,则在使用前立即用所提供的稀释缓冲液稀释Cas9蛋白质。将稀释后的蛋白质储存在冰上,最长不超过6小时。

Cas9蛋白质的储存 — 等分Cas9蛋白质溶液,储存于-20°C非无霜冰箱可保存一个月。长期保存则存储于-70°C下。

 

 细胞的准备

使用前约18-24小时,将细胞置于完全生长培养基中。对于大多数细胞类型,培养物在转染时应达到50-80%汇合。

 

制备SygRNA® RNP和使用TransIT-CRISPR®转染

6孔板实验方案:
在转染前立即制备TransIT-CRISPR:SygRNA® RNP

  • TransIT-CRISPR转染试剂温热至室温并轻轻涡旋。
  • 将20 μM SygRNA® crRNA和tracrRNA原液各1.5至15 μl移至冰上的无菌管中。
  • 将1至2 μl Cas9蛋白质(30至60 pmol)加入含有合成crRNA和tracrRNA的试管中。轻轻地上下移液混合。在冰上孵育30分钟以形成复合物。
  • 向Cas9 RNP中加入250 μl无血清或减量血清培养基。
  • 向Cas9 RNP中加入5 - 6.25 μl TransIT-CRISPR试剂。(已在U2OS细胞中优化)可能需要针对每种细胞类型优化Cas9 RNP与TransIT-CRISPR试剂的比例。
  • 轻轻地上下移液混合。
  • 在室温下孵育15-30分钟,以形成转染复合物。

将转染复合物分配到完全生长培养基中的细胞中

  • 对于每个样品,在所有孔中逐滴分配TransIT-CRISPR®:SygRNA® RNP。
  • 轻轻地来回和左右摇动培养瓶,以均匀分布TransIT-CRISPR:SygRNA® RNP复合物。
    孵育细胞24-72小时,然后收获用于测定。不必更换培养基。

其他信息可在TransIT-CRISPR技术信息页面上找到。
* TransIT是Mirus Bio LLC.的注册商标。

 

SygRNA® RNP的制备和核转染

12孔板实验方案:制备Nucleofector®溶液和细胞

  • 根据制造商的说明制备Nucleofector试剂盒试剂。
  • 以12孔板为例:在12孔板中获得足够的细胞,每孔约有250k个细胞(每孔最终体积为1 ml)。
  • 离心浓缩细胞,吸去培养基。
  • 在Nucleofector溶液中重悬细胞,添加补剂,制备体积应足以在每个孔分配100 μl溶液。
  • 在12孔板的每个孔中加入0.5 ml完全培养基。

制备SygRNA® RNP

  • 用含有10 mM Tris、pH值为7至8的缓冲液*将SygRNA® crRNA和tracrRNA稀释至10 μM工作溶液。
  • 将每种RNA的0.6至7.5 μl(6 pmol至75 pmol)吸移至冰上的无菌管中。
  • 使用所提供的稀释缓冲液将Cas9蛋白质稀释至1 mg/ml,并储存在冰上。
  • 将1至5 μl(6 pmol至30 pmol)的Cas9蛋白质吸移至合成的crRNA和合成的tracrRNA中,轻轻混合,并在室温下孵育5分钟。SygRNA® crRNA和tracrRNA加上Cas9蛋白质的最终体积应小于20 μl。

核转染SygRNA® RNP

  • 把在Nucleofector溶液中重悬的100 μl细胞吸移到含有RNA和Cas9蛋白质的试管中,轻轻吸移以完全混合。
  • 将细胞 / RNP复合物悬浮液转移到经过认证的比色皿中。
  • 根据制造商的说明选择合适的Nucleofector程序来处理细胞。

将核转染的细胞分配到每个孔中

  • 立即向比色皿中加入400 μl完全培养基,轻轻将样品转移到准备好的12孔板的适当孔中。使用试剂盒随附的移液器,避免重复抽吸样品。
  • 让细胞生长24-72小时,然后收获用于测定。不必更换培养基。

交付Cas9 RNP的流程概述

图2. 交付Cas9 RNP的流程概述

 

用SygRNA® crRNA和tracrRNA RNP修饰AAVS1基因座

图3. 用SygRNA® crRNA和tracrRNA RNP修饰AAVS1基因座
用合成tracrRNA和靶向AAVS1的合成crRNA(以1:1摩尔比组合)加1 μg或5 μg Cas9蛋白质组成的RNP,对K562细胞进行核转染。转染后48小时进行AAVS1基因座上插入缺失的Cel-1突变检测。