3D类器官培养:开发及疾病的新体外模型


 2D与 3D细胞模型系统的对比

模型系统通过从分子至整个生物体水平概括身体过程与功能来促进生物学研究。人体由以高度专门化方式组织的细胞和非细胞材料组成。用一种体外模型系统很难模拟人类生物学的所有方面。与在2D平面上生长细胞相比,3D细胞培养模型更准确地代表活体生物体中细胞所经历的自然环境。

现有细胞模型系统的局限性
 

动物模型 2D细胞单层 3D细胞聚集体
  • 人类与动物生物学存在差异
  • 在成像和高通量研究中的可用性有限1
  • 成本高昂
  • 细胞失去表型
  • 缺乏细胞-细胞及细胞-基质之间的相互作用
  • 无法模拟体内条件下的细胞功能和信号通路
  • 瞬间模拟细胞组织和相互作用
  • 难以维持长期培养
  • 缺乏自我更新和分化的能力2


 什么是类器官

类器官是源自原代组织或干细胞的体外衍生3D细胞聚集体,其能够自我更新、自我组织并显示器官功能。3 类器官通过提供以下条件解决现有模型系统的局限性:

  • 类似于原代组织的组成和结构:类器官含有少量自我更新的干细胞,可以分化成所有主要细胞谱系的细胞,其分化频率与生理条件相似。
  • 体内条件的相关模型:类器官与任何模型系统在生物学上更相关,并且能操纵壁龛组分和基因序列。
  • 稳定的延伸培养系统:利用干细胞的自我更新、分化能力以及固有的自我组织能力,类器官可冷冻保存用作生物库,亦可无限扩增。

小鼠小肠上皮类器官

图1. 小鼠小肠上皮类器官按照Clevers等,科学 2013概述的实验方案,从成年小鼠肠组织生成3D类器官。类器官细胞在培养的第3-5天开始形成管腔和芽结构,并在第7-10天左右形成复杂的腺窝样结构。这些腺窝样结构区域在功能上类似于成年肠的功能,其中LGR5+ 小肠干细胞的分裂插入位于腺窝基部的潘氏细胞。


 类器官是如何产生的?

通过提供适当的物理和生化线索,从原代组织或多能干细胞(诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC))产生类器官4

物理线索:为细胞附着和存活提供支持。实例包括胶原蛋白、纤连蛋白、巢蛋白和层粘连蛋白。

生化线索:调节信号通路,从而影响增殖、分化和自我更新。实例包括EGF、FGF10、HGF、R-spondin、WNT3A、视黄酸、GSK3β抑制剂、TGF-β抑制剂、HDAC抑制剂、ROCK抑制剂、头蛋白、激活素A、p38抑制剂和胃泌素。


 类器官的应用

类器官具有生理学相关性,适用于分子和细胞生物学分析,在基础研究和转化应用中具有很大的前景。  

发育生物学:源自ESC和iPSC的类器官保留着其发育阶段的特征,有助于研究胚胎发育过程、谱系规范和组织稳态。发育生物学还阐明了干细胞及其壁龛的发育。

  • 通过由调节Wnt、BMP和FGF信号通路诱导的连续分化步骤,研究了脑24、胰腺25和胃7等器官的发育。


传染病的疾病病理学:类器官代表器官的所有组成部分,适用于研究影响特定人类细胞类型的传染病。

  • 来自健康儿童的iPSC的肺类器官携带可用于研究流感病毒复制的干扰素调节因子-7基因的无效等位基因26
  • 来自人类iPSC的前脑类器官用于研究齐卡病毒对神经祖细胞的感染27


再生医学:移植来自成体干细胞的类器官有助于取代受损的器官或组织。此外,使用CRISPR / Cas9技术进行基因校正的可行性,可用于治疗单基因遗传性疾病。

  • 小肠类器官在移植到小鼠模型时保留了小肠的特征,例如绒毛的形成和潘氏细胞的存在28


药物毒性和功效测试:能否测试药物对代表性靶标/器官(肠道、肝脏和肾脏)的功效和毒性,可能会潜在地限制与动物使用相关的伦理问题。

  • Hyman肾脏类器官被用来证明顺铂的肾毒性11


个性化药物:来自个体患者的成体干细胞的类器官使得能够对药物反应进行离体测试。

  • 结肠类器官用于确定罕见CFTR突变患者的治疗选择29
  • 肿瘤类器官可用于评估个体患者水平的药物反应。

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从原代组织和多能干细胞生成的类器官及其应用

图2. 从原代组织和多能干细胞生成的类器官及其应用
 

表1. 用于各种类器官细胞类型发育的生长因子和生物化学品概览。
 

类器官

 

来源

 

培养条件

 

类器官中的细胞类型

 

参考文献

 

 

 

hPSC

 


内胚层诱导:Rock抑制剂(Y-27632)激活素ABMP5
球状体生成:WNTFGF头蛋白视黄酸
类器官形成:头蛋白视黄酸EGF
成熟:EGF
LGR5+ 细胞、粘液细胞、胃内分泌细胞 

 

7

 

 

 

hAdSC

 


EGFRspondin头蛋白FGF10WNT胃泌素烟酰胺TGFβ抑制剂

 

LGR5+ 细胞、小凹粘液细胞、腺体粘液细胞、主细胞和肠内分泌细胞

 

13

 

 

 

hPSC

 

内胚层诱导:激活素ABMP4
后肠分化(球状体生成):FGF4WNT3A
类器官形成:FGF4WNT3A
成熟:
RSpondin1头蛋白EGFFGF4、WNT
肠细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞

 

30

 

  hAdSC

 

建立:EGFRspondin头蛋白、WNT3A、烟酰胺胃泌素TGFβ抑制剂p38抑制剂
分化:没有WNT3A、p38 MAP激酶抑制剂烟酰胺
肠上皮衍生物和干细胞

 

31

 

结肠
 

 

hAdSC

 


建立:EGFRspondin头蛋白、WNT3A、烟酰胺胃泌素TGFβ抑制剂p38抑制剂
分化:没有WNT3A、p38 MAP激酶抑制剂烟酰胺

 

上皮细胞和间充质衍生物

 

31

 

肝脏
 

 

hAdSC

 


建立:头蛋白WNTROCK抑制剂
分化:胃泌素EGFRspondinFGF10肝细胞生长因子烟酰胺TGFβ抑制剂毛喉素

 

功能性肝细胞

 

14

 

 

 

hiPSC

 

内胚层诱导:激活素A
肝脏特化:BMP4FGF2肝细胞生长因子
成熟:制瘤素M
功能性肝细胞

 

32

 

胰腺
 

 

hAdSc

 


建立:TGFβ抑制剂头蛋白R-Spondin 1WNT3AEGFFGF10烟酰胺
分化:未报告

 

上皮导管细胞

 

23

 

前列腺
 

 

hAdSc

 


EGFR-Spondin1头蛋白TGF-β抑制剂、p38 MAP激酶抑制剂FGF10FGF2PGE2烟酰胺DHT

 

分化的CK5+ 基底细胞和CK8+ 腔细胞

 

17

 

 

 

hPSC

 

内胚层诱导:激活素A
前肠内胚层分化:BMP、TGF-βWnt抑制剂
腹侧肺气道祖细胞:Wnt、BMP、FGF、RA激活剂
肺类器官:WntFGFcAMP糖皮质激素

间充质和肺上皮细胞

 

33

 

 

 

hPSC

 


神经诱导:N2补充剂NEAA肝素
分化:N2补充剂2-巯基乙醇胰岛素
成熟:维生素A视黄酸

 

祖细胞群,产生成熟的大脑皮层神经元

 

24

 

肾脏
 

 

hPSC

 


中间中胚层诱导:Wnt、GSK3α抑制剂
类器官形成:GSK3α抑制剂、FGF9

 

肾元和内皮细胞

 

1134

 


 类器官细胞培养产品

培养器皿
 

零件号 描述
CLS431751 70 μM细胞过滤器(康宁)
CLS431752 100 μM细胞过滤器(康宁)
CLS3473 24孔超低粘附板(康宁)
SCNY00100 Steriflip 100 μm尼龙网,25 /包
SCNY00060 Steriflip 60 μm尼龙网,25 /包
SCNY00040 Steriflip 40 μm尼龙网,25 /包


 

零件号 描述
SCR103 胶原酶 I 型
C6885 胶原酶 II 型
C5138 胶原酶 IV 型
10269638001 胶原酶 / 中性蛋白酶
D4693 中性蛋白酶 II
G9020 胃泌素 I 人
A6964 细胞消化酶
4716728001 重组DNase I,不含RNase

类器官基质
 

零件号 描述
E1270 来自Engelbreth-Holm-Swarm鼠类肉瘤的ECM凝胶
E6909 ECM凝胶,生长因子减少

细胞系
 

零件号 描述
SCC111 表达293T细胞系的R-Spondin1

培养基及培养试剂

零件号 描述
D8537 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
A2058 牛血清白蛋白
E9884 乙二胺四乙酸(EDTA)
D5796 DMEM,高葡萄糖
P4333 青霉素-链霉素
G8541 稳定的谷氨酰胺(200 mM,溶液)
A9165 N-乙酰半胱氨酸
H3375 HEPES
N3376 烟酰胺
A4403 L-抗坏血酸
SCM012 NDiff 神经-2培养基补剂(200x)
G0800 GS21™ 补剂(50X)
SCM110 人ES/iPS神经诱导培养基
SCM018 拟胚体(EB)形成培养基
C2874 CryoStor® 细胞冷冻保存培养基

 

生长因子及细胞介素

零件号 描述
SRP3196 重组鼠EGF
E9644 重组人EGF
SRP3227 重组鼠头蛋白
SRP4675 重组人头蛋白
SRP3292 重组人R-Spondin-1(CHO细胞)
SRP6487 重组人R-Spondin-1(HEK293细胞)
GF154 重组小鼠Wnt3a
F8924 重组FGF-10
SRP4037 重组FGF-2


 

小分子
 

零件号 描述
Y0503 Y-27632(ROCK抑制剂)
S7076 SB202190(p38 MAP激酶抑制剂)
SML1046 CHIR99021(糖原合酶激酶3抑制剂)
SML0788 A83-01(TGFβ激酶 / 激活素受体样激酶(ALK 5)抑制剂)

 

组织学试剂
 

零件号 描述
47608 多聚甲醛(PFA)36%水溶液
34860 甲醇
P2287 TWEEN® 20粘稠液体,经细胞培养测试
T8787 Triton™ X-100
F6057 Fluoroshield™,含DAPI,组织学封固剂
HPA012530 抗-LGR5抗体


 参考文献

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