细胞培养的常见问题:污染

培养污染:概述

 

虽然“细胞培养污染”通常会让人想起细胞和混浊培养基中的细菌,但培养瓶中有害的入侵者有多种形式。病毒和化学污染物也会对培养物健康产生相当大的影响,应确保细胞系不会交叉污染,这对结果的可重复性至关重要。

细胞污染有多普遍?根据FDA、ATCC和其他人的研究,估计单被支原体污染的细胞培养物占5-30%。在一项研究中,常见细胞系的病毒污染发生率超过25%,非致细胞病变病毒甚至比支原体更难检测,因为培养物健康无法反映前者的存在。

 

Cell contamination

 

控制特定污染物的关键有时与其检测容易程度有关。细菌、真菌和酵母污染物通常肉眼可见,且会迅速杀死培养的细胞 - 但微小的形态变化难以识别支原体等重要的微生物入侵者。相比之下,常规光学显微镜根本无法检测到病毒,通常是观察到不明原因的脱落或细胞健康状况不佳甚至死亡等迹象才发现的。近年来,生物学界面临的最大问题之一是研究的细胞系受到污染甚至是彻底错误鉴别。有关这一重要主题的更多信息,请单击此处了解细胞系交叉污染的原因和分布情况,以及如何评估细胞系鉴定的完整性。

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污染类型

 

细菌、真菌、酵母:微生物污染物

bacterialfungalyeast

细菌、真菌(包括霉菌)和酵母污染通常肉眼可见,因为培养基的浊度和颜色会迅速改变(前提是培养基补充有酚红这一最常见的无毒pH指示剂)。标准的光学显微镜还可揭示细菌和真菌的结构,因此每日用显微镜观察培养物可在早期检测到微生物污染,一旦第一个迹象出现,就能采取适当的行动。特别是,需要迅速去除污染的培养物,从而保护邻近的培养物和无菌的组织培养环境,包括培养箱、浴室和生物安全柜。另外, 细菌和真菌的特定检测应作为常规和定期质量控制筛选程序的一部分。

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微生物污染的常见原因和预防措施

 

根源/原因 预防措施
技术:
操作、移取、加液
 非无菌表面和设备 清除未立即使用的物品的工作区域。  
瓶颈和瓶外以及工作台上有溢出物 定期用70%酒精擦拭。不要倾倒液体。用移液器、自动分液器或转移装置加液。如果必须要倾倒,则:(1)平稳进行,(2)丢弃倒出的瓶子。
触摸或握持移液管时太靠近尖端,触摸瓶颈、螺旋盖内部 在刻度上方握持移液器。用外包装套管处理无菌移液器。
从废液杯中回溅   用漏斗将废液丢弃到烧杯中,或者尽可能使用真空抽吸废液。
培养物或瓶子上沉淀的灰尘或皮肤颗粒;手或器具放在敞开的板、瓶、皿上方 切勿在敞开的容器上方过手、工作。不要在敞开的瓶或皿上方(垂直层流和开放式工作台)或后方和上方(水平层流罩)工作。
操作员的头发、手、呼吸、衣服
皮肤、头发或衣物上的灰尘掉落或吹入培养物中     彻底洗手,穿上无绒实验室服。使用专为培养室准备的实验室服。扎起长发或戴上帽子。必须说话时要背向操作台。
谈话、咳嗽、打喷嚏等产生的气溶胶 避免感冒时工作,或者戴口罩。
材料和试剂  
溶液  
非无菌试剂和培养基 使用前将溶液过滤或高压灭菌。
灭菌不彻底 使用记录温度计或无菌指示器监控高压灭菌器的性能。如果怀疑有污染,则检测或培养灭菌溶液。
商业供应商的质量控制不佳 仅从质量和来源有保证的信誉良好的供应商处购买培养基、缓冲液和血清
玻璃器皿和螺旋盖  
储存过程中沾染的灰尘和孢子 盖子用箔覆盖。在将瓶子放到机罩之前,用70%酒精擦拭。
仪器、移液器  
无菌性不可靠   使用来自信誉良好的供应商的独立包装、无菌的一次性用品。使用前采取干热法对可重复使用的物品进行消毒。
接触非无菌表面或其他材料 不要抓握仪器或移液器的会进入培养容器的部分。
使用的培养瓶和培养基瓶  
来自培养箱或冰箱的灰尘和孢子        使用螺旋盖代替塞子。瓶子在放入机罩之前进行擦拭。对板使用二级防护。
储存或孵育条件不佳 在储存或孵育期间用铝箔盖住瓶盖和瓶颈。定期清理储存空间和培养器。
盖子下有培养基并流到瓶外 丢弃所有瓶颈外部有溢出物的瓶子。不要倾倒。
仪器和设备  
室内空气  
穿堂风、涡流、湍流、灰尘、气溶胶     为组织/细胞培养物提供合适的空间。减少人流量和无关的活动。定期擦拭地面和工作台。
层流生物安全柜  
过滤器穿孔 定期检查过滤器的孔以及是否渗漏。
过滤器不干净 检查过滤器上的压降。
溢出物,特别是在工作台的缝隙或下方 定期对工作台四周和下方进行消毒。确保酒精进入缝隙。
CO2加湿培养箱  
在潮湿的环境中,壁和架子上容易滋生霉菌和细菌 根据制造商说明书定期清理并进行适当消毒。
强制空气循环中携带的孢子等 将打开的皿放入带有密封盖的塑料盒中(但不要密封盖子)。
水浴锅等设备  
用于加热溶液的水浴锅受到污染       定期清洗水浴锅并消毒;用70%酒精彻底擦拭容器,干燥后再转移到生物安全柜中使用。
高压气瓶、泵等上的灰尘 考虑使用非水基(珠)加热浴。在放进培养室之前,用70%酒精擦拭。
引进的细胞系    
输入的生物材料  
怀疑在源头或运输过程中被污染 单独处理这些细胞系,最好隔离检疫。在不加抗生素的情况下将培养物培养两周,以此检查是否污染。通过相差显微镜和支原体Hoechst/DAPI染色,目测检查污染情况。

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支原体

支原体是一种不具有细胞壁的细菌,因此不受通过抑制细胞壁形成来抑制细菌生长的抗生素的影响。支原体的形态多变,且细胞大小在0.15至0.3μm范围内,而标准的细胞培养过滤方法通常使用0.22μm孔径的过滤器,这意味着支原体很难被过滤掉。与绝大多数的其他细菌污染物不同,支原体不会被肉眼检查到,并且由于其形态和特别小的尺寸而很难用光学显微镜进行检测。培养物中的支原体滴度可以达到108个生物/mL而不会导致培养基混浊。它们虽然通常不会杀死感染的哺乳动物细胞,但会通过改变细胞代谢、引起染色体畸变、减缓细胞生长和干扰细胞附着而对培养物造成严重影响。简而言之,支原体会显著影响使用受影响细胞系进行的绝大多数实验的结果。

 

Common DNA detection agents such as DAPI or Hoescht reveal the presence of mycoplasma

DAPI或Hoechst等常见DNA检测试剂结合荧光显微镜揭示污染培养物中存在的支原体(右)。

实验室中各种来源的支原体污染是很大的挑战。除了通过污染的补充剂(如胎牛血清)引入外,由于某些支原体物种存在于人体皮肤上,因此还会因无菌技术不足而引入。支原体在邻近的污染细胞培养物中高度可传播。因为孔径为0.22或0.45μm的标准培养基过滤装置无法过滤掉这些微小生物,所以必须用孔径为0.1μm或更小的膜过滤培养基和缓冲液。


预防、检测和消除支原体污染

支原体一旦污染了培养物,就会迅速扩散到实验室的其他区域。严格遵守良好实验室规范是关键,强烈建议对支原体进行常规检测,以成功控制支原体污染。三种最常用的检测方法包括支原体培养 DNA染色法PCR检测。我们为支原体的检测和消除提供了多种解决方案。即使您觉得实验室中不存在这种污染物,建立常规的培养物支原体筛查也至关重要。

 

预防微生物污染:抗生素是解决办法么?

组织培养中的一种解决方法是常规使用抗生素,单独使用或与抗真菌剂混合使用。正如医生开出的治疗性抗生素一样,持续或不恰当地使用抗生素会导致难以根除的耐药菌株的形成,因而需要使用可能对细胞培养物有毒的后一代抗生素。最近的研究格外关注细胞在抗生素存在条件下培养时基因表达改变的可能性。

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病毒污染

病毒是培养过程中最难检测的细胞培养污染物之一,需要用显微镜检查,而这对绝大多数研究实验室来说不切实际。病毒可能来源于患者或宿主动物细胞,已经有几种具有生物技术意义的细胞系含有内源性逆转录病毒。更多时候,细胞是被存在于用于培养它们的动物源材料中的病毒感染的。小尺寸的病毒很难从培养基、血清和其他生物来源的溶液中去除。但是,由于大多数病毒具有宿主特异性,甚至具有组织特异性,这会限制其跨物种或跨组织感染的能力。虽然病毒在细胞培养中比许多研究人员认识到的更为常见,但如果它们不会对细胞产生细胞病变或其他不利影响,它们可能会严重干扰细胞培养,也可能不会。

除了会影响培养细胞的性能之外,使用病毒感染细胞培养物的一个主要问题是它们对实验室人员会造成潜在健康危害。在处理来自人类或其他灵长类动物的组织或细胞时,应始终使用特殊的安全预防措施,避免病毒感染(HIV、乙型肝炎、艾巴氏、猿疱疹B型病毒等)从细胞培养物传播到实验室人员。在处理潜在的危险组织、培养物或病毒时,应咨询机构环境安全员。有关细胞培养实验室人员风险评估的更多信息,请单击此处

 

降低细胞培养物病毒污染发生率的最佳措施:

*限制提取细胞的生物来源(供应商、动物)的数量
*选择对病毒不是很敏感的动物/细胞
*使用储存库的源细胞进行病毒检测并提供无病毒细胞系的认证

 

化学污染

无生命的细胞培养污染物通常归为“化学”污染物。这些污染物可能来自培养基或缓冲液中使用的试剂或水,或来自设备和日常用品。例如自由基、金属离子、消毒剂/洗涤剂残留物,甚至是上游细菌污染物去除后持续存在的内毒素。


防止化学污染的提示:

*始终使用 实验室级水制备缓冲液和溶液,以及重悬冻干的试剂。
*任何可重复使用的实验室器皿必须彻底冲洗、风干——高压灭菌对洗涤剂残留物没有影响
*只从提供内毒素检测认证的供应商处获取培养基、补充剂和血清(FBS, FCS)

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防止和消除污染的一般技巧和技巧

 

在生物安全柜内工作

在生物安全柜内工作时,记住气流是帮助维持无菌环境的关键,这一点很有帮助。后方和前方通风口应始终保持畅通,以获得有效的气流。在进行任何实际操作之前,应在机柜中放置所有必需的材料,以尽量减少操作员袖子和手上污染物转移的可能性。

在将待用物品放入机柜之前,至少将气流打开20分钟。放入机柜的所有物品必须先喷洒70%(v/v)无菌酒精,然后用无绒布擦拭,以防止灰尘和微粒进入机柜。在打开任何顶部或容器之前确保气流良好,使气流可吹扫到可能已经进入工作区域的颗粒。

working in the safety cabinet

移液和气溶胶的预防

一次性塑料移液管——也称为血清移液管,容量为1-100 mL——是细胞培养不可或缺的工具。这些必须单独包装,确保无菌。遵守以下指导可最大限度地减少与移液相关的污染和安全风险。

  • 使用自动移液器辅助装置,每个移液器辅助装置限制在单个机柜中使用。为避免污染,请定期拆卸移液器辅助部件并消毒。确保移液器辅助装置的过滤器储存良好并定期更换。
  • 尽可能使用堵塞的移液器(顶部用棉花塞住),特别是在转移介质时。避免将液体吸入移液器塞。如果塞子意外弄湿,请立即更换移液器过滤器。
  • 展开一部分,将血清移液管末端安装到移液器辅助装置,然后取下纸套,从而避免接触移液管。
  • 为避免产生污染性气溶胶,请勿在培养基或移液器中产生气泡。

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消毒

设计用于培养废物、工作台和设备的消毒/净化的方法不仅须使污染风险降至最低,而且对实验室人员必须安全。使用浓缩的消毒剂时,请始终穿戴合适的个人防护装备(PPE),如手套和护目镜。选择的手套应防处理的物质。制造商的图表有助于确定给定任务的最佳手套。主要消毒剂的分组及其相对优点可归纳如下:

 

次氯酸钠或漂白剂

  • 良好的通用消毒剂
  • 可抗病毒
  • 对金属具有腐蚀性—不得用于金属表面(如离心机)
  • 易被有机物灭活,应经常制备新鲜溶液
  • 使用商业漂白剂在废液中形成10%(v/v)溶液或进行表面消毒

酒精(如乙醇、异丙醇)

  • 有效浓度:乙醇为70%,异丙醇为60-70%
  • 对细菌有效。乙醇对绝大多数病毒有效,但对无包膜病毒无效
  • 异丙醇对病毒无效
  • 醛是刺激物,其使用应有限


酚类消毒剂不支持作为欧盟生物杀灭剂产品指令审查计划的一部分,应避免使用。

 

 精选参考文献

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  2. Neimark, Jill. Line of attack. SCIENCE Vol. 347, Issue 6225, pp. 938-940.  DOI:10.1126/science.347.6225.938.
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  5. Merten, O.W. Virus contaminations of cell cultures – a biotechnological view. Cytotechnology 39(2): 91-116. (2002).
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