用胰蛋白酶解离细胞

有兴趣获得更多这样的内容吗?来加入已经订阅Cell Informer简讯的8,000多名同行吧!


 


 用胰蛋白酶解离细胞的背景

各种蛋白水解酶用于从粘附底物上脱离细胞,其中最常使用的是丝氨酸蛋白酶家族成员胰蛋白酶。胰蛋白酶由胰腺外分泌细胞分泌的酶原 — 胰蛋白酶原产生;胰蛋白酶作用于赖氨酸或精氨酸的C末端侧。其最佳活性在37℃达到,因此预热胰蛋白酶可加速脱离。用高胰蛋白酶浓度长时间孵育,会使细胞表面蛋白条带化,并杀死细胞。

胰蛋白酶为许多细胞类型所耐受;然而,在蛋白质组学研究和无血清培养中需要避免胰蛋白酶。根据应用和细胞类型,可采用不同成分和浓度的胰蛋白酶。下面讨论一些属性。

  • EDTA(乙二胺四乙酸二钠):钙存在下的粘附分子决定细胞-细胞以及细胞-基质间的相互作用。为了减弱这种相互作用,经常会在胰蛋白酶中添加EDTA,其螯合二价阳离子(Ca2+,Mg2+)。
  • 酚红:胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH范围内实现(5466615)。在此范围内的酚红呈粉红色。由于环境条件,胰蛋白酶的pH可能变为酸性,呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。通过用NaOH调节pH至7.4-7.6可以优化胰蛋白酶活性。 
  • 稀释剂:将浓缩的胰蛋白酶溶解或稀释在不含Ca2+或Mg2+的缓冲盐溶液中,例如汉克平衡盐溶液(产品编号:H9394),以维持pH和渗透平衡。此外,一些胰蛋白酶产品含有0.9% NaCL作为稀释剂,而不是汉克平衡盐溶液。
  • 来源和形式:胰蛋白酶的主要来源是猪,其以冻干粉末形式或溶液形式提供。为了避免动物或微生物产品,重组牛胰蛋白酶也在玉米中表达,称为Trypzean溶液(T3449)。
  • 浓度:根据细胞类型和应用,胰蛋白酶以不同浓度使用。对于强附着细胞系,使用2.5%至0.25%(1X至10X倍稀释)的胰蛋白酶。尽管有需要细胞表面蛋白质完整性的研究,但一般采用较低浓度(0.05%胰蛋白酶)溶液。

 用胰蛋白酶解离细胞的实验方案

  • 将胰蛋白酶溶液、平衡盐溶液(不含Ca+2和Mg+2的溶液)以及生长培养基预热至37°C。
  • 检查细胞以确保细胞健康且无污染。
  • 从烧瓶中取出并丢弃培养基。
  • 用不含Ca+2和Mg+2离子的平衡盐溶液轻轻冲洗细胞,然后除去溶液。也可以用胰蛋白酶溶液洗涤牢固贴壁的细胞。然而,对于敏感细胞,首选平衡盐溶液。
  • 将适量(0.5ml / 10cm2)预热后的胰蛋白酶溶液添加至烧瓶侧壁。轻轻旋转内容物以覆盖细胞层。
  • 将容器在室温下孵育2-3分钟。牢固贴壁的细胞可以在37°C快速脱离。在显微镜下观察细胞。脱离的细胞在显微镜下呈现圆形且有折射光。如果脱离的细胞少于90%,则将烧瓶再孵育2分钟,并每隔30秒在显微镜下观察一次细胞。
    注意:防止细胞暴露于胰蛋白酶溶液太长时间(> = 10分钟)。
  • 一旦细胞脱落,加入2倍体积预热的完全生长培养基以灭活胰蛋白酶。向细胞层表面轻轻移液培养基数次,以确保细胞回收率 > 95%。对于无血清培养物,以等摩尔浓度添加黄豆胰蛋白酶抑制剂(产品编号:T6414)以抑制胰蛋白酶。
    注意:剧烈移液会导致细胞损伤。
  • 将细胞悬液转移至试管中,并以300-1000×g轻轻离心5-10分钟。除去上清液,将细胞沉淀团轻轻重悬于预热的完全生长培养基中。用血细胞计数器和台盼蓝排除法或自动细胞计数器,去除所需样品以确定活细胞的细胞密度。 
  • 将剩余溶液稀释至接种密度,并将适量体积吸移至培养瓶中,然后将其置于培养箱中。
烧瓶面积 培养基体积
25 cm2 5 – 10 ml
75 cm2 10 – 30
175 cm2 40 – 150 ml

 


 用胰蛋白酶解离细胞的故障排除:细胞脱离

 

问题 原因 解决方案
细胞难以从培养瓶中脱离下来。
  • 酶活性(胰蛋白酶)丧失或浓度低。
  • 存在血清(抑制胰蛋白酶活性)。
  • 汇合度高,酶无法进入细胞-底物界面。
  • 使用最佳浓度的新鲜酶。
  • 彻底冲洗以去除血清。
  • 以较低的细胞密度使细胞脱落。
细胞粘附困难。
  • 使用了高浓度的胰蛋白酶。
  • 胰蛋白酶未完全失活。
  • 附着因子和血清不足。
  • 污染。
  • 柠檬酸盐降低了钙的利用率,从而减少了细胞附着。
  • 细胞膜损伤。
  • 以最佳浓度和更短时间进行胰蛋白酶消化。
  • 添加血清以灭活胰蛋白酶。
  • 使用抗生素来挽救培养物,如果14天后污染未被清除,则丢弃这批被感染的细胞。
  • 清除和降低细胞培养系统中使用的柠檬酸盐水平。
  • 避免长时间暴露于胰蛋白酶。将培养基和培养物存放在远离荧光灯的地方,以减少自由基的毒性作用。
细胞脱离且活力低下。
  • 污染。
  • 缺乏足够的附着因子和血清。
  • 细胞高度汇合。
  • 氧化应激导致细胞变圆并从底物上脱离。
  • 胰蛋白酶溶液渗透度(pH)发生变化。
  • 丢弃被污染的细胞。
  • 添加适当的附着因子和血清。
  • 散开和疏导细胞。
  • 通过添加白蛋白、谷胱甘肽,最大限度地减少氧化应激。
  • 检查胰蛋白酶溶液的pH值。
细胞脱落后凝块。
  • 使用了高浓度的胰蛋白酶。
  • 剧烈移液。
  • 剧烈、长时间离心。
  • 单层细胞年龄增加。
  • 以最佳浓度进行胰蛋白酶消化。
  • 温和移液。
  • 温和离心(125Xg 10分钟)。
  • 在细胞达到100%汇合之前散开和疏导细胞。
细胞膜损伤和细胞死亡。
  • 脂质过氧化增加,降解了细胞膜导致细胞脱离。
  • 无血清培养基中缺乏血浆铜蓝蛋白,会催化羟基自由基的形成并破坏细胞膜。
  • 溶液中铁浓度增加,它支持细胞表面的自由基活性,破坏细胞膜。
  • 过氧化氢在亚铁离子和亚铜离子存在下形成羟基自由基。
  • 核黄素光分解形成过氧化氢。
  • 在氧化物、过氧化物、碳酸盐、羟基、磷酸盐和硫化物阴离子存在下,沉淀导致锌的丧失。
  • 添加抗坏血酸和谷胱甘肽以抑制脂质过氧化。
  • 在配方中加入白蛋白和谷胱甘肽,以降低氧化损伤。
  • 通过转移,隔离铁传递到细胞。
  • 将甘露醇/丙酮酸盐加入培养基中,以络合并稳定过氧化氢。
  • 在细胞培养物中加入新鲜的核黄素,避免细胞培养系统长时间暴露在光照下。
  • 添加锌与白蛋白 / 胰岛素的复合物以提高锌含量,并尽量减少氧化应激,以防止形成氧化物、过氧化物和硫化物。

返回顶部

有关更多信息,包括胰蛋白酶的各种其他应用和实验方案,请单击此处


 用胰蛋白酶解离细胞的材料