CHOZN®平台技术手册

产品描述/概述

CHOZN®平台是CHO(中国仓鼠卵巢)哺乳动物细胞表达系统,用于快速简便地筛选和扩大克隆来生产大量重组蛋白。该平台的关键优势在于拥有CHOZN®ZFN修饰的GS - / - CHO细胞系,该细胞系消除了内源性谷氨酰胺合成酶(GS),使细胞对必需氨基酸L-谷氨酰胺产生营养缺陷。在对获得的细胞系进行分离时,这些细胞内的靶向基因修饰使得研究人员能够进行更强大、更快的克隆选择。CHOZN®平台还包括一套经过优化、cGMP标准生产、化学成分明确的(CD)生长和生产培养基和补料产品集,可最大限度地提高克隆生长和重组蛋白产量。这些培养基和补料已通过大规模生长和生产进行了优化,以更好地用于初始细胞工程过程和稳定的细胞系筛选过程。其配方均使用无动物成分原材料开发,且都有良好的采购记录以及非常稳定的可制造性。

CHOZN®ZFN-修饰的GS - / - CHO细胞系使用Sigma专有的CompoZr®锌指核酸酶(ZFN)技术构建。ZFN是一类生物工程DNA结合蛋白,通过结合用户指定的位点并引起双链断裂(DSB)来促进靶向基因组编辑。之后,细胞通过内源DNA修复过程(非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR))来修复这种靶向DSB。这些修复过程可以进而产生精确靶向的基因组编辑,从而获得具有特定基因搅乱(敲除)、整合或修饰的生物体或细胞系。

谷氨酰胺合成酶(EC 6.3.1.2)3催化谷氨酸和氨缩合形成谷氨酰胺,在氮代谢中起重要作用。谷氨酰胺合成酶(GS)是生物制药行业中最常用的选择标记物之一。功能性GS酶缺乏或GS酶被抑制剂灭活的细胞,需在培养基中补充L-谷氨酰胺以确保细胞存活。L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)加入培养基后,可作为一种小分子不可逆的GS酶活性抑制剂。在含有功能性GS基因和酶的细胞中,可采用MSX抑制内源性GS的活性,从而筛选已用外源GS基因转染并产生重组蛋白的克隆。但MSX可能带来某些危害,并且将其从生物制药相关的细胞培养过程舍去有许多好处(例如监管审查较少、生产成本较低、差异因素少等)。无源性GS活性的细胞系使得研究人员能完全不使用MSX,同时轻松快捷地进行克隆选择和重组蛋白质生产。 SAFC的CHOZN®GS - / - 细胞系是世界上第一个整合了专门设计的突变的CHO细胞系,可使相关基因产物失活。该细胞已记录进cGMP库,并已进行过完整法规检测,在培养液中显示出稳健的生长能力,并且可用于无MSX的筛选过程,以制备和生产大量重组细胞系。

 

注意事项和免责声明

CHOZN®GS - / - 细胞系及相关培养基和补料仅供研发使用,不适用于药物、家庭或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息,请参阅安全数据说明书。

 

储存和稳定性

收货后请立即将细胞储存在气相液氮(约-150℃至-180℃)中。所有液体介质避光2-8℃保存,所有干粉介质2-8℃干燥地点避光保存。

 

背景:CHOZN®GS - / - 细胞系

CHO细胞是用于商业规模生产复杂生物药物(抗体、酶、生长因子等)的优选宿主表达系统。非整倍体、需要脯氨酸的CHO-K1细胞系是来自成年中国仓鼠卵巢亲本CHO细胞系的稳定亚克隆(Puck et al, 1958)。高产重组CHO衍生细胞系的制备、分离和表征一直是制药工业的长期挑战。目前筛选高产克隆的方法通常涉及包含特定生长要求(即DHFR)或需要抑制关键代谢酶(即谷氨酰胺合成酶)的细胞系。随后在仅有重组克隆存活的条件下培养转染子筛选重组克隆。CHOZN®GS - / - 细胞系是第一个内源性GS基因内含有突变的CHO细胞系,需要依赖于培养基中的外源成分补充L-谷氨酰胺。这种独特的细胞是通过Sigma的CompoZr®ZFN技术对CHO-K1细胞系(Sigma 85051005)进行修饰获得的。

随后用CompoZr® GS ZFN对(ZFNGSA9075 / ZFNGSB9372,Sigma货号ZFNGS)(靶序列CCAAGCCCATTCCTGGGAactgGAATGGTGCAGGCT)转染悬浮的修饰后CHO-K1细胞系(参见下面的图1)。该ZFN对的靶序列位于CHO GS基因的外显子6中。该序列是编码GS酶的底物结合结构域的序列,因此,该位置上的突变能产生非功能性蛋白。

将ZFN转染的细胞库进行单细胞克隆,并根据ZFN靶位点突变进行克隆筛选。几个克隆在GS位点含有双等位基因敲除突变(参见下图2)。在对克隆进行广泛表征后,确定稳健性最优的克隆。该CHOZN®GS - / - 细胞系的克隆ID为2E3。随后将来自克隆2E3的细胞在cGMP条件下在EX-CELL® CD CHO融合培养基中储存于细胞库中,并根据主细胞库的FDA和EMEA测试要求进行彻底表征。

 

CHO GS gene and targeted sequence modification sites

图1. CHO GS基因和靶向序列修饰位点的示意图。ZFN靶位点已标识出,并且ZFN结合位点由方框中突出显示的序列表示。ZFN9075 / 9372对的靶位点位于GS基因的外显子6内,负责编码蛋白质的底物结合结构域。

 

ZFN transfection of the CHO-K1 cell line

图2. 由ZFN转染CHO-K1细胞系引起的克隆2E3(CHOZN®GS - / - 细胞系)内GS突变的序列。GS基因两个拷贝的双等位基因搅乱已标识出。等位基因1在其等位基因内具有10个碱基的缺失和2个碱基被取代,等位基因2具有17个碱基的缺失。下方的流程图表示了使用CHOZN®平台所需的实验步骤。在各个步骤和主要流程的侧面中记录相应的时间线。

 

CHOZN GS平台工作流程和时间表

与CHOZN®平台一起使用的培养基、补料和补充剂

:有关重组技术、存储和稳定性的信息,请参阅每个产品的产品信息说明书/技术手册。

不含L-谷氨酰胺(cGMP)的EX-CELL®CD-CHO融合培养基(#14365C-液体和24365C-干粉)

EX-CELL®CD CHO融合培养基是一种化学成分明确、不含动物成分的培养基,适用于CHO细胞的长期生长。该培养基中不存在任何大的大分子,从而使研究人员能够从细胞中流水线化分离和纯化出分泌的蛋白质。该培养基不含L-谷氨酰胺,可提高培养基稳定性,消除导致氨积聚的L-谷氨酰胺降解,并为GS筛选的CHO细胞培养提供合适的培养基。EX-CELL®CD CHO融合培养基在cGMP生产质量条件下生产,具有完整的原料文档,可以以液体或粉末的形式提供。

不含L-谷氨酰胺(cGMP)的EX-CELL®CHO克隆培养基(C6366)

EX-CELL®CHO克隆培养基是一种无动物成分的培养基,可支持中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系克隆存活和生长,结果与使用10%胎牛血清的传统方法相当。该培养基专为满足生物技术行业的需求而开发,专为适应无血清悬浮培养的重组CHO细胞系的单细胞克隆而设计。该培养基不含L-谷氨酰胺,可提高培养基的稳定性,消除导致氨积聚的L-谷氨酰胺降解,并为GS筛选的CHO细胞培养提供合适的培养基。该培养基在cGMP生产质量条件下生产,具有完整的原料文档,以液体的形式提供。

EX-CELL®Advanced™CHO补料分批培养基(货号14366C-液体/ 24366C-干粉)

EX-CELL®Advanced™CHO补料分批培养基是化学成分明确的新一代培养基平台。该配方根据性能、物理、法规和安全设计规范等10,000多个数据点的多变量分析开发,用于与Advanced™CHO Feed 1配合使用,可在补料分批培养中获得卓越的平台性能。

EX-CELL®Advanced™Feed 1 (货号24367C(含葡萄糖)/ 24368C(不含葡萄糖))

EX-CELL®Advanced™CHO Feed 1是独立包装的新一代补料,含有高度浓缩的关键必需源材料。该配方根据包括性能、物理、法规和安全设计规范等10,000多个数据点的多变量分析开发,用于与Advanced™CHO补料分批培养基结合使用,在补料分批培养中具有优异的滴度性能。

所需的细胞培养试剂


细胞培养试剂 制造商 货号  
CHOZN®GS - / - 细胞 SAFC CHOGS
EX-CELL® CD CHO融合培养基 SAFC
14365C(液体)
24365C(粉末)
EX-CELL®CHO克隆培养基 SAFC C6366
EX-CELL®Advanced™CHO补料分批培养基 SAFC 14366C(液体)
24366C(干粉)
EX-CELL® Advanced™
补料1
SAFC 24367C(含葡萄糖)
24368C(不含葡萄糖)

L-谷氨酰胺(200 mM) Sigma-Aldrich
SAFC
G7513
59202C
D -(+)-葡萄糖(45%溶液) Sigma-Aldrich G8769
二甲基亚砜(DMSO) Sigma-Aldrich D2438
L-蛋氨酸亚砜亚胺(MSX)(任选) Sigma-Aldrich M5379 或76078 (cGMP 级)
碳酸氢钠 Sigma-Aldrich S5761
36-38%的盐酸 Sigma-Aldrich H1758
50%氢氧化钠 Sigma-Aldrich 415413
组织级水 Sigma-Aldrich W3500

 

所需设备/材料/试剂

  • 表达载体(质粒DNA),含有目的蛋白质的表达基因区域和用于代谢选择的GS基因(推荐质粒浓度~1μg/μl)
  • 无菌过滤装置;0.22μm,1000 ml容量(Millipore®Stericup™SCGPU10RE或同等产品)
  • 小容量移液器和无菌吸头(Rainin®Classic套装或同等产品)
  • 无菌移液器(1ml、2ml、5ml、10ml、25ml、50ml)
  • T-25cm2和T-75cm2悬浮细胞(疏水表面处理)培养瓶(Greiner Bio-one 690195和658195或同等产品)
  • 15ml和50ml无菌锥形离心管(Corning 430052和430290或同等产品)
  • 125ml无菌锥形无挡板、带通气帽培养瓶(Corning 431143或同等产品)
  • 96孔悬浮细胞处理(疏水表面)培养板(Greiner Bio-one 655185或同等产品)
  • 24孔悬浮细胞处理(疏水表面)培养板(Greiner Bio-one 662102或同等产品)
  • 50ml TPP(Techno Plastic产品)TubeSpin®
  • 无菌微量离心管(1.5ml Eppendorf®或同等产品)
  • 4mm电击管(Sigma Z706094或同等产品)
  • 电穿孔仪器(Bio-Rad公司Genepulser®或同等产品)
  • 带有摆动转子的冷冻离心机(转速可达3000x g)
  • CO2培养箱(5%CO2,37℃,加湿)
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 轨道振动筛板或CO2振荡器培养箱系统(ATR Multitron II或同等产品)
  • 37℃水浴
  • 生物安全柜(II类; A2型; ISO 5)
  • 冰箱(4℃)
  • 冰柜(-20℃)
  • 超低温冰箱(-80℃)
  • 液氮(LN2)冷冻罐;推荐气相(-150℃至-196℃)
  • 无菌冷冻管(Nalgene 5000-1020或同等产品)
  • 冷冻标签(耐LN2
  • LN2冷冻罐
  • 控制速率冷冻容器(Nalgene“Mr Frosty” 或冷却速度约为1℃ / min的控制速率冷冻设备)
  • 70%异丙醇(2-丙醇;溶于H2O中浓度为70%,Sigma 563935)

 

CHOZN® 平台用户实验方案

注:以下操作步骤只能由经过培训的人员操作:

  • 使用可能具有生物危害性的材料。
  • 所有的细胞培养步骤应至少符合生物安全1级(BSL-1)法规。
  • 使用生物安全通用预防措施(世卫组织 实验室生物安全手册; 第三版,2004)。
  • 所有细胞和培养基处理步骤应使用无菌技术(不建议在以下方案中任何时候添加抗生素/抗真菌剂)。

注:本文方案中的所有细胞培养和培养基处理必须在ISO 5级清洁环境的HEPA过滤(II类)生物安全柜中进行。

 

第I部分:初始解冻和 CHOZN® GS-/- 细胞库的培养基制备

注1:请参阅产品指南中关于其他培养基和补充剂的重悬、存储和稳定性信息的建议。
注2:GS筛选的生产克隆和细胞系应始终在不含L-谷氨酰胺的培养基中培养(见第VI部分)。

I-A:EX-CELL®CDCHO融合液体培养基补充有6mM L-谷氨酰胺(在整个技术手册中称为“生长培养基”)

试剂与仪器

  • EX-CELL®CDCHO融合培养基(Sigma 14365C)
  • 无菌过滤装置0.22微米(1000 ml容量)
  • 无菌移液器
  • 生物安全柜(II类; A2型; ISO 5)
  • 冰柜(-20C)
  • L-谷氨酰胺;200mM (Sigma G7513)
  • 冰箱(2-8C)
  • 37℃水浴
  • 70%异丙醇(置于表面去污的喷雾瓶)

 

操作步骤

以下为1 L生长培养基(补充6mM L-谷氨酰胺的EX-CELL®CDCHO 融合培养基)的制备操作步骤:

    i)    制备补充剂
           a. L-谷氨酰胺:在37℃水浴中解冻装200mM L-谷氨酰胺的存储瓶,直至完全溶解。
          解冻后,未使用的L-谷氨酰胺可以在2-8℃下保存两周。
    ii)   根据下表,在1 L EX-CELL®CDCHO 融合培养基中添加30ml 200mM的L-谷氨酰胺。
    iii)  (可选)使用1000ml容量的无菌过滤装置过滤完全培养基以确保培养基无菌。
    iv)  在培养基瓶上标记制备日期,并于2-8℃暗处储存。
    v)   一个月后将补充谷氨酰胺的未用培养基全部丢弃。

CHOZN®GS亲本细胞的生长培养基(EXCELL®CDCHO 融合培养基 +  6mM谷氨酰胺)

 

材料 货号(Sigma-Aldrich) 所需体积 终浓度
EX-CELL® CD CH融合培养基 14365C 1L 1X
L-谷氨酰胺(200mM) G7513 30ml 6mM

 

第II部分:CHOZN®GS细胞(cGMP库)初代培养/解冻和传代培养。


目的

本实验方案详述了CHOZN®GS 细胞的初代培养步骤。
:请谨记亲本CHOZN®GS 细胞存在L-谷氨酰胺营养缺陷,因此培养基须含有生长所需的L-谷氨酰胺。

 

试剂和仪器

  • T-75cm2悬浮细胞(经疏水表面处理)培养瓶(Greiner Bio-one 690195或同等产品)
  • 15ml无菌锥形离心管(Corning 430052或同等产品)
  • 125ml无菌、无挡板、带通气盖锥形培养瓶(Corning 431143或同等产品)
  • 50ml TPP(Techno Plastic 产品)TubeSpin®试管
  • 无菌移液器
  • 装有CHOZN®GS 细胞(Sigma CHOGS)的冷冻瓶
  • 注:细胞在93%EX-CELL CD-CHO融合生长培养基(含6mM L-谷氨酰胺)和7%二甲基亚砜(DMSO)中以约7.5×10 6个细胞/ /ml接种。
  • EX-CELL®CDCHO融合细胞生长培养基(按照第I-A部分所述制备,含6mM L-谷氨酰胺)
  • 37℃的水浴
  • 生物安全柜(II类; A2型; ISO 5)
  • 离心机
  • CO2培养箱(5%CO2,37C,加湿)
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 轨道振动筛板(Erlenmeyer培养瓶设置为125 rpm,TPP®TubeSpin管设置为200 rpm)
  • 70%异丙醇(装在喷雾瓶中)

 

操作步骤

i)  解冻细胞

a.    将培养箱设置为37C和5% CO2。在培养箱底部放置一小盘无菌水来湿润培养箱,如果有湿度控制功能,则湿度设置为80%。
b.    将生长培养基在37℃水浴中预热。
           注意:培养基置于水浴中不能超过1-2小时。
c.    取一个T-75cm2悬浮细胞(经疏水表面处理)无菌培养瓶。
d.    取一个15 ml无菌锥形离心管。
e.    将8ml预热无菌EX-CELL®CDCHO融合细胞培养生长培养基(含6mM L-谷氨酰胺)无菌转移至15ml无菌锥形离心管中。
f.    从LN2冰柜中取出一管冷冻的CHOZN®GS细胞(1ml)。
g.    立即在37℃水浴中轻轻旋转小瓶直至解冻(约1分钟)。
           不要完全浸没小瓶以避免污染。
h.    从水浴中取出小瓶,并用70%异丙醇喷洒试管外表面避免污染。将试管置于生物安全柜中。
i.    打开试管前先等待乙醇从表面完全干燥。

ii)  洗涤细胞

a.    将细胞从冷冻管无菌转移到含有新鲜EX-CELL®CD CHO融合细胞培养生长培养基(含有6mM L谷氨酰胺)(上述步骤i-e)的无菌15 ml锥形离心管中。
b.    将细胞悬浮液在15-20℃下220rcf离心5分钟以沉淀细胞。
c.    使用无菌移液器,小心地吸出澄清培养基。注意不要搅乱细胞沉淀。丢弃吸出的培养基,保留细胞沉淀。
           注:小心 - 澄清的培养基含有DMSO。根据当地法规妥善处理。

iii) 细胞传代培养

a.无菌添加10 ml新鲜的EX-CELL®CDCHO融合细胞培养生长培养基(含6mM L-谷氨酰胺)至含有细胞沉淀的锥形离心管。通过移液器轻轻上下吹打打散细胞团块,重悬细胞沉淀。
b. 将整个细胞悬浮液(10ml)无菌转移至无菌T-75cm2悬浮细胞(经疏水表面处理)培养瓶。
c. 将细胞在37℃湿润的CO2培养箱中孵育(不摇动)20-28小时。
           注:大多数细胞不会粘附在培养瓶上。运输时要小心。
d.24小时后,测定并记录细胞密度和活力。
           注:如果储存在最佳储存条件下(气相液氮),细胞应该在24小时内复苏,活力> 90%。
e. 将10 ml静态培养物从T-75cm2培养瓶转移到125 ml无菌锥形培养摇瓶中来传代培养。(带通气盖,无挡板,含有新添加的10 ml新鲜完全生长培养基。总体积约20 ml)。将培养瓶置于轨道振动筛板上,125-130rpm振荡。
          注:如果使用TPP管代替锥形瓶,请将振动筛速度设置调整为200rpm。
f. 摇瓶培养阶段的细胞储液维护请按照第III部分所述的方案操作。

 

第III部分:CHOZN® GS-/- 细胞储液维持

目的

本方案详述了亲本C HOZN® GS-/- 细胞储液维护维持步骤。

试剂和仪器

  • 125 ml无菌锥形培养瓶(无挡板,带通气盖)Corning 431143或同等产品
  • 50 ml TPP(Techno Plastic产品)TubeSpin®试管
  • 完全(含有6mM L-谷氨酰胺)EX-CELL®CD CHO融合细胞培养生长培养基(按照第I-A部分或I-B部分所述制备)
  • 轨道振动筛板(锥形摇瓶设置为125-130 rpm;如果是TPP,则设置为200rpm)
  • 水浴(设定为37℃)
  • CO2 培养箱(5%CO2 ,37℃,加湿)
  • 无菌移液器
  • 生物安全柜(II类;A2型;ISO 5)
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 70%异丙醇(装在喷雾瓶中)

操作步骤(每3-4天进行一次)  

i)确认培养箱设定为37℃,5%CO2 ,并且含有调节湿度的水(湿度~80%)。
ii)将完全生长培养基在室温或37℃水浴中预热。
iii)从培养瓶中无菌吸取少量细胞培养样品,通过台盼蓝拒染法,或使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。如果细胞活力低于90%,请勿继续。
             注:如果细胞活力低于90%,请排除故障之后继续操作。
iv)确定接种至新培养瓶的培养细胞等适当体积,起始细胞密度应为2.0-3.0  x105细胞/ 毫升(参见下表中细胞培养瓶的适当体积)。
v)将适量的细胞无菌转移至新培养瓶中,并加入预热的生长培养基,达到所需的体积。
vi)在含有5%CO2 ,37℃湿润的培养箱中的轨道振荡器上125-130rpm孵育培养瓶。
             注:如果使用TPP管代替锥形培养瓶,请将振动筛速度设置调整为200rpm。
vii)每周至少两次重复上述步骤来传代细胞,并根据下图需要将培养容积扩大。

 

根据培养瓶容量确定适当的体积

摇瓶 体积范围
50 mlTPP®TubeSpin管 25-30ml
125 ml摇瓶 17-35 ml
250ml摇瓶 60-100ml
1L摇瓶 300-400ml

 

第IV部分:CHOZN® GS-/-细胞的冻存和细胞建库

目的

本实验方案详细介绍了建立工作CHOZN® GS-/-细胞库的步骤。本例为10 x 1ml小瓶库。

试剂和设备

  • 无菌冷冻管(Nalgene 5000-1020或同等产品)
  • CHOZN® GS-/-初代细胞培养物
  • EX-CELL® CD CHO融合生长培养基(按照第I部分制备)
  • DMSO (Sigma D2438) 注:为了获得最佳效果,请使用未开瓶的新鲜溶液
  • 冷冻管标签(必须耐液氮)
  • 15 ml和50 ml无菌锥形离心管(Corning 430052和430290或同等产品)
  • 无菌移液器
  • 生物安全柜(II类;A2型;ISO 5)
  • 离心机
  • 可控速率冷冻容器(N Nalgene “Mr Frosty”)或可控速率冷冻设备
  • 70%异丙醇
  • 超低温冰箱(-80℃)
  • 液氮冷冻盒
  • 液氮冰箱
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板

 

操作步骤

i)   如果使用手动控制速率的冷冻系统,请在容器中注入新鲜的70%异丙醇和/或按照制造商的说明进行操作。
ii)  标记冷冻管。
iii)  在无菌条件下,向生长培养基中加入新鲜的100% DMSO,使DMSO终浓度达到7%,从而制备冷冻培养基。在本例中,通过向50 ml无菌锥形管中加18.6 ml EX-CELL® CD CHO融合生长培养基和1.4 ml新鲜的100% DMSO来制备20 ml冷冻培养基。
iv)  在无菌条件下,从培养瓶中取出少量细胞培养物,使用细胞计数板或自动细胞计数仪通过台盼蓝拒染法计数。如果细胞活力低于90%,请勿继续。
v)  计算每个冷冻管(体积为1 ml)获得5x106 – 1.0 x107个细胞所需的细胞储备量和冷冻培养基。在本例中,一管总共需要大约1 x 108个细胞。
           注:细胞制备开始后,必须迅速完成。建议从储备培养物中取出细胞到将含有库的可控速率冷冻容器放入-80℃冰箱的总时间不超过30分钟。
vi)  在无菌条件下,将计算量的储备培养物转移到适当大小的无菌锥形离心管中。
vii)   在15-25℃下,220 rcf离心5分钟。
viii)  小心地吸出上清,不要搅乱细胞沉淀。
ix)    用计算量的冷冻培养基轻轻重悬细胞。
x)     轻轻吹打细胞悬液,彻底混匀。
xi)    在无菌条件下,立即将1.0 ml细胞悬液分装到标记的冷冻管中。盖紧。
xii)    将小瓶快速转移到准备好的可控速率冷冻系统容器(手动)中,然后转移到-80℃冰箱,或者将小瓶转移到可控速率冰箱中,然后按照推荐的程序冷冻过夜。
xiii)   在冷冻18-72小时内将冷冻小瓶转移到液氮冰箱的蒸汽相。

 

第V部分:转染CHOZN® GS-/-细胞

目的

本实验方案介绍了电穿孔转染CHOZN® GS-/-细胞的操作步骤。本方案中的转染条件针对CHOZN® GS-/-亲本细胞系进行了优化,操作正确时可实现60-80%的转染效率(根据转染库中荧光报告构建体的表达测定)。

:虽然不推荐,但也可以使用基于脂质的转染方法,但转染效率可能较低。推荐使用为悬浮CHO细胞设计的转染试剂(即Mirus TransIT-PRO®转染试剂盒;MIR5700)。使用此类试剂时,请遵循制造商推荐的方案。

 


pCMV-GFP转染的CHO细胞(库)转染24小时后的图像。

:如果用户计划由转染的培养物建立多个稳定的库,建议同时转染至少2-3次,并在开始选择过程之前将转染的细胞合并在一起。

试剂和设备

  • 生物安全柜(II类;A2型;ISO 5)
  • CHOZN® GS-/-初代细胞培养物
  • EX-CELL® CD CHO融合生长培养基(在第一部分制得)
  • 4 mm电穿孔杯(Sigma Z706094)
  • T-25 cm2悬浮细胞(疏水表面处理)培养瓶(Greiner Bio-one 690195和658195或同等产品)
  • 含有目的蛋白基因表达盒的质粒DNA,以及用于代谢选择的GS表达盒(推荐质粒浓度为~1 μg/μl)
    :质粒DNA制剂应无菌(乙醇沉淀法),并重浮于不含盐或缓冲液的无菌水中。
  • 15 ml和50 ml无菌锥形离心管(Corning 430052和430290或同等产品)
  • 无菌移液器
  • 离心机
  • 70%异丙醇
  • 无菌微量离心管(1.5 ml Eppendorf®或同等产品)
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • CO2培养箱(5% CO2,37℃,加湿)
  • Bio-RadGene Pulser®或类似的电穿孔仪

操作步骤

    i)   (转染前24小时)细胞培养物制备。
           a.    接种一瓶CHOZN® GS-/-细胞(来自储备细胞培养物),最终细胞密度为0.5x106个细胞/ml。
    ii)    电穿孔(转染当天)。
           a.    制备完全生长培养基(参见第I部分)
                  :使用EX-CELL® CD CHO完全融合生长培养基(含6 mM L-谷氨酰胺)作为转染和复苏介质。
           b.    标记适当数量的T-25 cm2悬浮细胞培养瓶(每次转染使用一个)。
           c.    在无菌条件下,向每个培养瓶中加入5.0 ml EX-CELL® CD CHO完全融合生长培养基。
    iii)    标记电穿孔管,并将其放在冰上冷却。
    iv)    标记混合细胞悬液和DNA的无菌微量离心管。
    v)    如下制备用于电穿孔的细胞:
           a.    在无菌条件下,从培养瓶中取出细胞培养物样品,使用细胞计数板或自动细胞计数仪通过台盼蓝拒染法计数。最低活力必须>90%才能进行电穿孔。
           b.    计算转染所需培养物的适当体积(6.25x106细胞/次转染)。
           c.    在无菌条件下,将计算量的储备培养物转移到适当大小的无菌锥形离心管中。
           d.    在15-25℃下, 220 rcf离心5分钟。
           e.    小心地吸出上清,不要搅乱细胞沉淀。
           f.     将细胞沉淀重悬于EX-CELL® CD CHO完全融合生长培养基中(每次转染使用1.0 ml培养基)。
    vi)   电穿孔
           a.    每次电穿孔时,取0.8 ml细胞悬液(总共~5x106个细胞)和所需量的DNA在无菌微量离心管中混合。每次转染推荐使用30-50 μg质粒DNA(单次转染中DNA的体积不得超过50 μl)。
           b.    将DNA/细胞混合物转移到冷却的电穿孔杯中,按如下设置进行电穿孔:

       电压 电容 脉冲
  300 V 950 μF 指数衰减

            c.    将~0.6 ml的各电穿孔细胞转移到装有5 ml生长培养基的制备好的T-25 cm2悬浮细胞培养瓶中(尽量不要转移白细胞碎片)。

           d.    将T-25 cm2培养瓶在37℃和5% CO2条件下孵育24(+/- 4)小时。
           e.    要生成转染稳定的库,请按照第VI部分所述的方法将细胞置于选择范围内。

 

第VI部分:稳定库筛选及复苏

目的

以下描述了用于稳定库创建的两种选项:96孔微型库技术以及批量筛选技术。

在微型库筛选方法中,目的是创建稳定转染细胞的小库。既然每个库都会从小的初代群开始,库与库之间便会存在更多差异。通过筛选一系列不同的微型库,快速分离出高产量、稳定的库的概率就更高。批量筛选技术会产生关于细胞复苏的信息,以及转染成功的早期指示。采用批量库方法而开发的稳定库滴度通常比微型库方法更低。推荐采用批量库方法作为对照。

:批量筛选在化学成分明确的培养基中进行,而96孔微型库处理采用两种培养基进行(一种是化学成分明确,而另一种是无动物来源成分但化学成分不明确)。用于96孔微型库处理的EX-CELL® CHO颗粒培养基含有植物水解物。

A) 稳定库筛选与批量筛选(化学成分明确过程)比较

相对于微型库筛选法,批量筛选法筛选出的库很可能存活率更高且复苏时间更短。但批量库间的差异也很可能比微型库间更少。前几名批量库的最终整体滴度,很可能低于下述两种微型库方法。该过程是利用化学成分明确的培养基而进行的。

 

试剂和设备

  • 转染的细胞培养物(转染后24小时)
  • GS筛选培养基(含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO融合培养级)
  • T-25cm2及T-75cm2悬浮细胞(经疏水表面处理)培养瓶(Greiner Bio-one 690195及658195或同等产品)
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 15ml无菌锥形离心管
  • 无菌移液器
  • 离心机
  • 生物安全柜(II类,A2型,ISO 5)
  • CO2培养箱(5% CO2,37C,加湿)
  • 70%异丙醇

 

操作步骤

        i)    在转染后24小时,将转染后细胞从T-25 cm2 培养瓶转无菌移至15ml无菌锥形管。

        ii)    15-25C下220 rcf离心5分钟。

        iii)    小心吸取上清,注意不要搅乱细胞沉淀。
        iv)    使用10.0 mL不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO 融合培养基重悬细胞沉淀。
               (GS筛选培养基)(参见下表)。

        v)    将重悬的细胞转移至一支T-75   cm2 悬浮细胞培养瓶中。

        vi)    在筛选过程中每周整体更换库的培养基。
                a.    将T-75 cm2 培养瓶中的全部细胞培养物转移至一支无菌的15 ml锥形离心管中。
                b.    15-25C下220 rcf离心5分钟。
                c.    小心移除上清,注意不要搅乱细胞沉淀。
                d.    采用10-12ml的GS筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO融合培养基)重悬细胞沉淀,并将重悬的细胞转移至原始的培养瓶中
                e.    将培养瓶置于湿润的37C 5% CO2培养箱中进行培养。
        vii)    每两周对库进行计数。
        viii)   当从筛选的库恢复后(活力>90%且倍增时间稳定,约在转染后10-21天),每周库传代至3x106活性细胞/ml两次。稳定的库可扩展至摇瓶,以在此刻进行更一步的表征分析

B) 稳定库筛选与96孔操作方法(无动物成分过程)

在此选项中,细胞接种到含80% EX-CELL® CHO 颗粒培养基(Sigma C6366)和20% GS筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO融合培养基)混合物的96孔板中。


 

 

试剂和设备

  • 转染的细胞培养物(转染后约24小时)
  • GS 筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO融合培养基)
  • EX-CELL® CHO颗粒培养基(Sigma C6366)
  • 96孔经悬浮细胞处理(疏水表面)培养板(Greiner Bio-one 655185或同等产品)
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 15ml无菌锥形离心管
  • 无菌移液器
  • 离心机
  • 生物安全柜(II类,A2型,ISO 5)
  • CO2培养箱(5% CO2,37C,加湿)
  • 多通道微量移液器及无菌吸头
  • 70%异丙醇
  • 无菌0.2μm Millipore Steriflip®过滤装置(或同等产品)

 

操作步骤

        i)    在转染后24小时,将转染后细胞从T-25 cm2 培养瓶转无菌移至15ml无菌锥形管。
        ii)    15-25C下220 rcf离心5分钟。
        iii)   小心移除上清,并注意不要搅乱细胞沉淀。
        iv)   使用10.0 mL不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO融合培养基重悬细胞沉淀。
        v)    无菌吸取少量体积的样品并通过细胞计数板或自动细胞计数仪进行台盼蓝拒染法计数。
        vi)    根据下表制备96孔微型库接种培养基(80%克隆培养基和20% EX-CELL® CD CHO 融合培养基混合物)
               :不要向接种培养基中加入L-谷氨酰胺。

 

96孔微型库接种培养基

材料 货号(Sigma-Aldrich) 终浓度
EX CELL® CD CHO融合培养基 14365C 20%
EX CELL® CHO克隆培养基 C6366 80%



    vii)    根据5000细胞/孔的密度确定需要加入的总体积。

            每孔需要200ul的总体积(参考下方的指导图表)。
    viii)   通过加入适当量的96孔微型库接种培养基将细胞稀释至上述所需细胞密度。
            a.    注:可能需要对细胞进行梯度稀释以实现相应的浓度。
     ix)   使用多通道移液器将稀释后的细胞加入96孔板(每孔200ul)。
     x)    将细胞放置入37C湿润的CO2培养箱并在5天内不要对其进行干扰。5天后取出平板并检查是否存在过度增殖。
    xi)    每周用GS筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO融合培养基)替换蒸发的培养基。
    xii)    一旦细胞达到接近80%的汇合度并通过显微镜检查较为健康,便可将细胞按1:4的稀释比分配至含有200ul GS筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO融合培养基)的96孔板中(第一次传代板)。此操作应发生在接种后第10-21天,但也取决于表达载体的设计以及原始接种密度。
            注:如果需要,可从原始平板中去除上清进行初步的滴度筛选。
            但由于不同库有不同的生长速率,这种起始的筛选可能无法作为判断哪些库在经过扩大后会成为具有前领先性能的准确依据。
    xiii)   滴度筛选方法(可选)。该筛选可用于鉴定在扩展过程早期产量领先的稳定库,以减少最终扩大至摇瓶培养的库的总数。
            如果没有必要减少进入下一步的稳定库数量,则可进入第VII部分
            静态的7天检测并不能对微型库的排名顺序进行预测,但可用于确定可通过扩大以进行进一步分析的前20-30%的库。
            a.    一旦在二次传代板中的细胞达到了80%的汇合度,按1:5的比例将其加样至含有200ul筛选培养基的两支新的96孔板中。其中的一块板将会作为培养板而另一块板则用作终点检测以进行微型库产率筛选。
            b.    按照上述的方法对培养板进行传代,当细胞达到80%汇合度时按1:5的稀释比例将细胞进行分配,每周进行1-2次。
            c.    将终点检测平板孵育7天,并收集上清用于滴度定量(ForteBio或类似品)。
    xiv)   将选中的池进行扩展以实现进一步的表征分析(参考第VII部分)

第VII部分:稳定微型库的扩大和表征

目的

本文详述如何从增殖板进行库扩大。

操作步骤

推荐的扩大方法如下(表1),并附流程图概述。按推荐的顺序扩大细胞培养可以防止更激进的增殖方法引起的稳定库损失。当从静态平板向培养瓶扩大时,一定要用移液器从容器底部吸取培养基,以去除任何可能半粘连在塑料器皿上的细胞。当从静态T-75cm2培养瓶向摇瓶扩大时,建议在静态环境中保存少量细胞,以防细胞库难以适应振荡环境。

每个稳定库恢复和适应振荡培养条件所需的时间会根据表达载体设计和库的特征而变化。有些库可能比其他库更快扩大。保持库不过度生长或过于稀疏很重要,因为环境的每一个因素都可能对库的最终特征产生影响。

 

 

表1:推荐的扩大策略  

 

培养板/培养瓶规格 货号 培养基体积 何时扩增 通常所需天数
96孔板 655185 (Greinerone) 200μl /孔 80%融合 细胞复苏之后2-4天
24孔板 662102 (Greinerone) 500-750μl /孔 80%融合 3-5天
T-25cm2培养瓶 690195 (Greinerone) 4.5-6 ml VCD超过0.5x106   3-5天
T-75cm2培养瓶 658195 (Greinerone) 9-15 ml VCD超过0.5x106 2-4天
125 ml锥形瓶 摇瓶 431143 (Corning) 20-30 ml 每周传代2次至密度0.3x106 2-4天

 TPP®TubeSpin管/摇瓶的筛选方案

7天TPP®TubeSpin管/摇瓶检测(可选)

当细胞库适应在摇瓶或TPP®TubeSpin管生长后,可以通过TPP®TubeSpin管或摇瓶的7天终端检测,将微型库的数量缩减为更少的几个库。其过程与静态7天检测相似,接种细胞并培养7天,并在检测结束时进行滴度分析。该检测方法可以更好地预测微型库的排名顺序,并且可以将补料分批检测筛选的库缩小至20-30个。另外,也可以跳过该检测将所有微型库进行补料分批检测。

7天TPP®TubeSpin试管/ 摇瓶检测的步骤是,在一个培养瓶中的GS筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL CD CHO 融合培养基)上以0.3e6细胞/ 毫升接种。 培养7天。 在第3天和第5天加入3克 / 升葡萄糖。在第7天,除去上清液进行滴度分析。

补料分批检测

补料分批检测用于确定从哪个库得到单细胞克隆。该检测提供了稳定库的生长和生产力特征的信息(可以用来预测这些库的克隆的生长和生产力特征)。

请参阅第XII部分有关补料分批检测的说明。

 

第VII部分:MSX筛选稳定库(可选)

目的

根据需要,可以对稳定库施加更高的筛选压力以提高库滴度。在此过程中,通过向细胞培养基中添加L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)(GS抑制剂)来增加GS筛选效力。我们观察到一些库在接触MSX恢复后可以达到更高的滴度。但并非所有库都适用此方法,并且某些库无法从外加筛选压力中复苏。

 

试剂和仪器

  • 稳定的GS选择库
  • GS扩增培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL®CDCHO融合培养基+ 25μM MSX)
  • T-75cm2 悬浮细胞培养瓶
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 15ml无菌锥形管
  • 无菌移液器
  • 离心机
  • 生物安全柜(II类;A2型;ISO 5)
  • CO2培养箱(5%CO2,37°C,加湿)
  • L-蛋氨酸亚砜亚胺(MSX)M5379或76078(cGMP级)
    注:吸入或摄入MSX可能会有危险。准备和使用浓缩储液时,请遵守标准的有害物质处理注意事项。

 

操作步骤

     i)当库从无谷氨酰胺选择中恢复后,无菌吸取细胞培养物样品并使用细胞计数板或自动细胞计数仪通过台盼蓝拒染法计数。
     ii)将5×10 6个细胞从培养库转移到无菌的15ml锥形管中。

     iii)在15℃至25℃下以220rcf离心5分钟。

     iv)小心吸出上清液,注意不要扰乱细胞沉淀。

     v)将细胞沉淀重悬于含有25微摩尔 MSX的10 ml EX-CELL®CDCHO 融合中(GS扩增培养基,见下表)。

 

GS扩增培养基

材料 货号(Sigma) 最终浓度
EX-CELL® CD CHO融合培养基 14365 C 1X
L-蛋氨酸亚砜(MSX) M537976078(cGMP级) 25μM


   vi)将重悬的细胞置于T-75cm2培养瓶(10 ml)中。

   vii)   从培养瓶中无菌取出一小部分,用细胞计数板或自动细胞计数仪进行台盼蓝拒染法计数。
   viii)  每周为细胞库重新更换培养基。
            a.   将整个细胞培养物从T-75cm2培养瓶转移到无菌的15mL锥形离心管中。
            b.   在室温下以220rcf将细胞离心并沉淀5分钟。
            c.   小心除去上清液,注意不要搅动细胞沉淀。

            d.   将细胞沉淀重悬于10-12毫升新鲜GS扩增培养基中,并将重悬浮细胞转移回到原来的培养瓶中。
    ix)   每周两次对细胞库计数。
    x)当细胞库从MSX选择中恢复后(活力> 90%且倍增时间稳定,约转染后10-21天),每周两次将库传代至0.3×10 6个活细胞/ 毫升。此时稳定库可以按比例扩增到摇瓶进一步表征。
    xi)按照第IV部分中的方案对最稳定的细胞库建库,用GS扩增培养基代GS生长培养基。

 

第IX部分:通过有限稀释及后续扩大从稳定库中分离单细胞克隆(SCC)

目的

一旦生成了稳定库,可通过单细胞克隆的池进行高产量克隆的分离。如果生成了微型库,我们推荐从前两名或更高产量库中选择单细胞克隆。

 

试剂及设备

  • GS稳定库
  • 96孔悬浮细胞培养板
  • EX-CELL® CHO克隆培养基
  • 来自稳定库的条件培养基(参考第X部分)
  • GS筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO融合培养基)
  • 多通道微量移液器及无菌吸头
  • 无菌移液器
  • 生物安全柜(II类;A2型;ISO 5)
  • CO2培养箱(5% CO2,37°C,加湿)
  • 离心机
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 70%异丙醇

操作步骤

    i)   细胞接种
          a.   确定需要接种的96孔板数量。该数量取决于所需克隆的数量。使用该实验方法预计每板会有约10-40个克隆。
          b.   通过无菌操作从稳定库储存培养液中吸取细胞培养物样品并使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行台盼蓝拒染法计数。
          c.   计算用于接种所需的细胞培养物和培养基体积。每孔将会含有200ul以及平均0.5个细胞(终浓度为2.5细胞/mL)。
          d.   制备适量体积的克隆接种培养基:80% EX-CELL® CHO克隆培养基+ 20% 条件培养基(参考第X部分)。

 

克隆接种培养基

 

材料 货号(Sigma) 终浓度
Conditioned Medium (参考第X部分) 20%
EX-CELL® Cloning Medium C6366 80%


        e.   从稳定库储存培养液中移除适量体积的细胞并加入适量的Clone Plating Medium,以获得2.5个细胞/mL的最终细胞密度。
               可能需要通过对细胞进行梯度稀释以实现该浓度。
        f.    使用多通道移液器将稀释的细胞接种至96孔板(每孔200ul)中。
        g.   将平板置于培养箱中(37C,5% CO2,80%湿度)。为了实现最大的克隆效率,在平板可用于筛选前不要将平板从培养箱中拿出(约在接种后6或7天)。
    ii)筛选单细胞克隆
        a.   在接种后第6或7以及14天,通过显微镜观察孔中的单克隆。在这两天均加入20uL的GS筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO Fusion)
        b.   对确定要形成克隆的孔进行持续追踪。
        c.   当克隆达到70-100%汇合度时,将这些克隆整合至更少量的平板以实现更为简易的筛选。
    iii)滴度筛选方法(可选)。该筛选可用于鉴定在扩展过程中早期的前几名产出的稳定池以减少最终扩展至摇瓶培养的库总量。
         如果没有必要减少进入下一步的稳定池的数量,则可进入第xv部分。
        静态的7天检测并不能对微型库的排名顺序进行预测,但可用于确定可通过扩展以进行进一步分析的前20-30%的库。
        a.   一旦在二次传代板中的细胞达到了80%的汇合度,按1:5的比例将其分配至含有200ul筛选培养基的两支新的96孔板中。其中的一块板将会作为培养板而另一块板则用作终点检测以进行微型库产率的筛选。
        b.   按照上述的方法对培养板进行传代,当细胞达到80%汇合度时按1:5的稀释比例将细胞进行分配,每周进行1-2次。
        c.   将终点检测平板孵育7天,并收集上清进行滴度定量(ForteBio或类似品)。
    iv.) 将选中的库进行扩展以实现进一步的表征分析(请参考第七部分中的扩展及表征分析详细过程)。
    v.) 一旦通过第X部分描述的筛选方法鉴定出了前几名的克隆,可参考第九部分中描述的过程通过冷冻保存来进行单细胞克隆的储存,用GS筛选培养基(不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO Fusion)替换GS生长培养基 。
        a. :为了维持选择压力,使用GS筛选培养基(不含谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO Fusion)在储存前进行生产克隆扩大。

 

第X部分:用于单细胞克隆的条件培养基生产

目的

该实验方法描述了如何通过有限稀释进行用于单细胞克隆的条件细胞培养基生产的过程。条件培养基已被证明对于单细胞克隆过程有利,通过为克隆提供由指数期生长健康细胞而分泌的有利营养或因子而实现。

 

试剂及设备

  • 细胞:来自GS稳定转染池(处于指数增长期)的储存培养液
  • GS Selection Medium (不含L-谷氨酰胺的EX-CELL® CD CHO 融合培养基 )
  • 无菌摇瓶(确定大概的体积)
  • 无菌离心管(确定大概的体积)
  • 无菌0.2um Millipore Steriflip®过滤装置或同等产品
  • 无菌移液器
  • 37C水浴
  • 离心机
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 生物安全柜(II级; A2型;ISO 5)
  • CO2培养箱(5% CO2, 37°C,湿润的)
  • 轨道振荡板
  • 70%异丙醇

 

操作步骤

    i)   生产培养基的设置
          a.   确定生产培养基所需的体积并准备相应尺寸规格的摇瓶。
          b.   通过无菌操作从稳定库储存培养液中吸取细胞培养物样品并使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行台盼蓝染色计数。
          c.   计算从储存培养液中所需的细胞量以及新鲜GS筛选培养基所需的体积以达到10x106个细胞/mL的起始细胞密度。
          d.   通过无菌操作将计算得到的细胞体积从储存培养液转移至无菌的离心管中。
          e.    15C-20C条件下将细胞220 X g离心5分钟。
          f.   小心吸出上清并且不要搅乱细胞团块。
          g.   用适量体积的新鲜GS Selection Medium轻轻重悬细胞沉淀。
          h.   通过无菌操作从生产培养基中吸取细胞培养物样品并使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行台盼蓝染色计数。
          i.   起始的活细胞密度应当为0.9-1.2 x 106个细胞/mL。
          j.   将平板放置进位于轨道振荡板的培养箱(37C, 5% CO2, 80%湿度)中,设置速率125 rpm培养24小时(+/-4小时)。

    ii)   生产培养基收集(开始培养后24小时)。
           a.   通过无菌操作从条件培养基生产培养物中吸取样品并使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行台盼蓝染色计数。
           b.   将培养物转移至离心管中。
           c.    2440 X g离心5分钟。
           d.   将澄清的培养基(条件培养基)转移至无菌的50mL锥形管中。
                  小心不要搅乱细胞团块。
           e.   使用0.2um Steriflip®过滤装置或同等产品将澄清培养基进行过滤。
           f.   将过滤后的条件培养进行细胞系编号、“条件培养基”以及过期日期(收集日期后一周)标记。
    iii)  储存
            a.   条件培养基可在2-8C储存最长7天。

            b.   不要将条件培养基进行冷冻。

 

第XI部分:补料分批检测

目的

本节介绍了基本的补料分批检测技术,可用于筛选微型库和克隆(参见第VII部分和第IX部分)。该试验介绍的参数可用作基本指南;进一步优化有益于部分克隆或微型库。

 

试剂和设备

  • 细胞:GS稳定克隆(指数生长期)的储备培养物
  • GS筛选培养基(EX-CELL® CD CHO融合培养基,不含L-谷氨酰胺)
  • EX-CELL® Advanced™补料分批培养基(14366C/24366C)
  • EX-CELL® Advanced™补料1(24367C/24368C)
  • D-(+)-葡萄糖(45%溶液)Sigma-G8769
  • 抗体定量系统(Forte´Bio® Octet或同等产品)
  • 无菌摇瓶(确定适当的体积)
  • 无菌离心管(确定适当的体积)
  • 无菌移液器
  • 离心机
  • 自动细胞计数仪或细胞计数板
  • 生物安全柜(II类;A2型;ISO 5)
  • CO2培养箱(5% CO2,37℃,加湿)
  • 轨道式摇板
  • 70%异丙醇

 

步骤

补料分批检测

可以通过补料分批检测筛选生产r-蛋白的克隆和微型库。使用EX-CELL® Advanced™ CHO补料分批培养基和进料系统进行试验。无需适应。强烈建议对EX-CELL®Advanced™ CHO补料1进行滴定(2.5-10%),以确定特定步骤的最佳浓度。为获得最佳结果,建议仅在达到指数中期到晚期后开始补料。

i.)    细胞(克隆或稳定池)按比例扩大并适应悬浮培养后,在125 mL锥形摇瓶或TPP® TubeSpin管中接种30 ml EX-CELL Advanced CHO补料分批培养基(14366C),初始细胞密度为0.3×106个细胞/ml。

ii.)    在接种后第3、5、7、9和11天,在无菌条件下添加无菌葡萄糖(G8769)(至最终葡萄糖浓度为4 g/L)和5%起始体积的水合EX-CELL Advanced CHO补料1(参见上文),以此饲养培养物。

iii.)    试验过程中定期监测生长和增殖力特征

         a.) 收集少量细胞培养物样品,用自动细胞计数仪进行计数
         b.) 收集少量细胞培养物样品,通过离心使细胞沉淀,然后采用干涉量度法、HPLC或ELISA分析上清液

iv.)    培养物活力降到70%以下时终止试验。

 

第XII部分:台式生物反应器扩大蛋白生产

目的

只要鉴定出前2个或3个克隆,就可以使用微生物反应器或传统台式生物反应器检测每个克隆在受控环境中的性能。
建议评估2个或3个克隆,特别是在需要特定蛋白特征或特定工艺的情况下。

台式生物反应器扩大专用试剂和设备

  • 细胞:指数生长期GS稳定单一细胞群的储备培养物
  • GS筛选培养基(EX-CELL® CD CHO融合培养基,不含L-谷氨酰胺)
  • EX-CELL® CHOZN® Advanced培养基(液体;不含L-谷氨酰胺)
  • EX-CELL® CHOZN® Advanced补料(根据产品信息表制备的液体),不含L-谷氨酰胺
  • D-(+)-葡萄糖(45%溶液)(Sigma G8769)
  • 专为动物细胞培养设计的生物反应器
  • 生物反应器pH调节剂(Sigma B1185)或替代的碱性溶液,如碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钠

操作步骤

*在指数生长期对细胞进行传代至关重要。通过改变接种密度可以改变传代天数。

小规模(摇瓶扩大法)

接种微生物反应器或小规模反应器扩大时,在摇瓶中扩大细胞比较合适。表x显示了不同培养瓶尺寸的推荐工作体积。

1.       按照第2部分介绍的步骤解冻一小瓶克隆库细胞(用GS筛选培养基(EX-CELL® CD CHO融合,不含L-谷氨酰胺)代替生长培养基)。

2.        一旦细胞系在GS筛选培养基(EX-CELL® CD CHO融合培养基,不含L-谷氨酰胺)中呈悬浮状态,以0.3-0.4x106 vc/mL密度接种培养物,从而开始在摇瓶中扩大细胞。每次传代时,按照下表所示的比例增加摇瓶尺寸。

 

推荐的摇瓶扩大策略

 

培养瓶尺寸 货号 培养基体积 接种密度 通常需要的天数
125 mL锥形瓶 431143 (Corning) 20-30 ml 0.3x106vc/mL 3-4天*
250 mL锥形瓶 431144 (Corning) 50-100mL 0.3x106vc/mL 3-4天*
500 mL锥形瓶 431145 (Corning) 150-200mL 0.3x106vc/mL 3-4天*
1000 mL锥形瓶 431147 (Corning) 300-400mL 0.3x106vc/mL 3-4天*


大规模(Wave袋扩大法)

接种较大尺寸的生物反应器或多个小尺寸生物反应器时,在摇摆袋系统中扩大细胞比使用多个摇瓶好。
根据生物反应袋供应商的标准建议,可以在摇摆袋中培养CHOZN®细胞。下表中可以找到可与摇摆系统一起使用的步骤示例。

1.        按照第2部分介绍的步骤解冻一小瓶克隆库细胞(用GS筛选培养基代替生长培养基)。

2.        一旦细胞系在GS筛选培养基(EX-CELL® CD CHO融合培养基,不含L-谷氨酰胺)中呈悬浮状态,以0.3-0.4x106 vc/mL接种培养物,从而开始在摇瓶中扩大细胞。每次传代时,按照下表所示的比例增加摇瓶尺寸。

3.        细胞悬浮培养传代至少3次后,即可使用GS筛选培养基(EX-CELL®® CD CHO融合培基,不含L-谷氨酰胺)接种摇摆系统,接种浓度为0.3-0.4x106 vc/mL。接种摇摆袋的体积要小(遵循供应商说明的最小体积)。细胞处于指数生长期(生长过程类似于摇瓶中)时,向袋中加入新鲜GS筛选培养基(EX-CELL®® CD CHO融合培养基,不含L-谷氨酰胺),将细胞浓度稀释至0.3-0.5x106 vc/mL。袋子的工作体积增加,摇摆速度随之提高。在此过程中,始终确保细胞处于指数生长期。重复此过程,直至达到接种生产生物反应器的所需体积。



推荐的Wave袋扩大法参数  

 

参数 应用
工作体积

1-10升,20 L袋

温度

37oC

摇摆角度

8o

摇摆速度

10-25rpm

气流量 100ccm空气 + 5ccm CO2


生产方案:在台式生物反应器中进行补料分批生产培养试验(使用EXCELL® CHOZN® Advanced培养基和Advanced补料)

1.        将细胞以所需接种密度直接接种到EX-CELL® CHOZN® Advanced培养基中,然后加到生物反应器中。生产生物反应器的典型接种密度为0.3 - 1×106vc/mL。较高的接种密度也是合理的,但是不推荐接种物超过初始工作体积的20%。初始工作体积应设定在最终工作体积的60-80%之间。

2.        可能需要针对单个克隆优化pH、温度和DO等生物反应器参数。搅拌速度或气体流速等其他生物反应器参数会根据生物反应器的具体设计而变化。下表显示了使用CHOZN®克隆作为启动过程参考的参数示例。
注:在EX-CELL® CD CHO融合培养基中扩增的细胞可直接接种于生产培养基-EX-CELL® CHOZN® Advanced培养基中,无需适应性培养。

3.        将葡萄糖维持在2 g/L以上:补充适当体积使浓度增加至6 g/L。

4.        从密度达到2x106vc/mL或第3天开始添加5-15% EX-CELL® CHOZN® Advanced补料(以先到者为准)。每隔一天继续添加补料,直到检测结束。

5.        根据代谢物、生产和产品质量分析收集样品。

 
 
参数

 

1.2 L容器 1.5 L容器
工作体积

 

0.8-1L

4-5L

搅拌 叶轮 倾斜48 mm

倾斜/轮机 70mm

速度

150-300rpm
0.4-0.7m/s

150-250rpm
0.6-1m/s

功率输入

8-67W/m3

21-124W/m3

曝气 分布器 开管0.5m 环形分布器100um
喷射气 空气、O2、CO2 O2/CO2

流量分布器

0.1-0.15vvm(开管)

0.05-0.1vvd(环)

叠加气

空气 空气

叠加流量

 

 



 

材料