用于基因组编辑细胞快速表达验证和富集的CRISPR/Cas-GFP载体


 背景

在涉及ZFNs和CRISPR/Cas核酸酶的许多基因组编辑实验中,第一个挑战是实现质粒的成功递送和随后编码核酸酶的表达。尽管最终需要CEL-I检测、T7E1检测或深度测序来定量核酸酶诱导的插入和缺失(插入缺失),但通过实施快速报告核酸酶表达盒活性的方法,可以更快地进行实验故障排除。我们开发了一种Cas9-GFP表达盒,可将基因组编辑工作流程从最初的核酸酶筛选加速到单细胞克隆的最后阶段。该载体还包括一个U6-gRNA盒,为CRISPR/Cas的递交和表达创建一个单一的载体系统(图1)。

一些细胞类型和/或基因组位置比其他细胞类型和/或基因组位置更难以用核酸酶靶向。对于CRISPR转染和检测未能实现高水平切割的情况,富集编辑细胞的方法可能有用。使用我们的单载体系统,来自相同mRNA的Cas9和 GFP的共表达创造了通过荧光激活细胞分选(FACS) 为期望的基因组编辑富集细胞群的可能性。由于能够使用 FACS 检测和富集 GFP,它显著降低了基因组编辑应用中与单细胞克隆和基因分型相关的劳动力和成本。以下数据集说明了我们的单载体系统如何用于低和高水平切割的表达监测和 FACS 富集。

 

CRISPR/Cas-GFP 载体示意图

 

图 1 — CRISPR/Cas-GFP 载体示意图

 

图 2

 

图 2 — 在目前大多数 CRISPR 应用中,gRNA 和 Cas9 由两个单独的载体表达。人类KRAS基因座的gRNA设计显示,当转换为单一载体形式时,人类K562细胞中保持高水平的插入缺失诱导。单质粒GFP格式确保所有需要的CRISPR/Cas组分(例如 Cas9 和 gRNA 编码序列)能够被有效地传递到 GFP 阳性细胞中。

图 3

 

图 3 — 通过显微镜或 FACS 很容易监测 Cas9-GFP 表达盒的传递。这种特殊的载体使用 CMV 启动子驱动 Cas9-GFP 盒的表达,虽然 CMV 可用于多种常用的细胞类型,但它并不具有普遍的活性。例如,之前的 ZFN 项目已经表明 CMV 启动子在 HeLa 细胞中活性不高(内部,未发表的数据)。为了在 HeLa 中规避这一问题,ZFN mRNA 被用作瞬时表达 ZFNs 执行基因组编辑应用的有效替代方案。如果在尽管反复尝试后仍不能在特定的细胞类型中观察到 GFP 表达和核酸酶插入缺失活性,则使用 Cas9-GFP mRNA 可能是一个很好的选择来规避启动子/细胞类型的不相容性。这里描述的单载体系统包含一个 T7 启动子,用于体外转录 Cas9-GFP mRNA(图 1)。

 

图 4

 

图 4-当根据 GFP 表达将细胞组分为低、中、高池时,如图 3 所示,观察到插入缺失活性相应增加。对于靶向 KRAS 基因座的 gRNA,当比较未排序的群体与GFP 表达最高的前 2%细胞群体时,观察到插入缺失活性增加 4 倍。当针对基因靶标进行初始核酸酶筛选时,并非所有靶向 gRNA 设计都能产生可检测的插入缺失活性,而当前的 gRNA 设计规则无法根据序列内容或基因组背景预测活性。我们对 CCR5 进行了 gRNA 设计,最初未能产生可检测的插入缺失活性,并将其分为低、中、高 GFP 组分。之后可在中、高 GFP 组分中检测到插入缺失活性。该技术对于挽救具有切割位点的 gRNA 设计的活性是非常有用的,所述切割位点位于与供体 DNA(例如,靠近疾病 SNP)相容的最佳位置。

 


 结论

Cas9-GFP 表达盒提供高水平的基因组编辑活性,快速表达检测,以及一种用于富集和拯救最初不能产生可检测的插入缺失活性的 gRNA 设计的选项。通过使用我们的单一质粒设计,它确保所有 GFP 阳性细胞也具有所需的 CRISPR/Cas 组分。GFP报告分子可快速检测转染效率,节省与下游表达定量检测相关的时间和成本。这也允许快速排除与特定细胞类型相关的质粒传递和表达问题。我们的CRISPR/Cas 技术为靶向基因组编辑提供了一种快速且经济实惠的解决方案,允许实验室比以往更多地访问基因组编辑。


 材料