CRISPR / Cas核酸酶RNA指导的基因组编辑

Sigma-Aldrich很自豪地向全世界科研领域提供其最新的基因组编辑工具Sigma CRISPR。将近十年以前,Sigma-Aldrich是第一家提供商业化靶向基因组编辑技术的公司,其在这一领域拥有无人能比的专业知识。在制作具有特定靶向和强大切割活性的关键要求的基因组编辑工具时,这种经验尤为重要。我们新的Sigma CRISPR产品系列包括这两种产品系列,如今,我们通过快速简单的网络设计平台,将我们的技能送达您的手中。您可以通过下面的链接直接订购Sigma CRISPR产品,亦可在此浏览CRISPR的内容,以了解该技术的更多信息。

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 什么是CRISPR / Cas?

CRISPR代表"Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats"(成簇规律间隔短回文重复序列)。II型原核生物CRISPR“免疫系统”的发现,使得能够开发简单、易用、快速实施的RNA指导的基因组编辑工具。
 

CRISPR / Cas如何工作?

CRISPR通路在细菌中被发现,其功能很像免疫系统,可以抵御入侵的病毒和质粒DNA。来自入侵病毒的短DNA序列(间隔区)掺入细菌基因组内的CRISPR基因位点,并充当先前感染的“记忆”。再感染引发互补的成熟CRISPR RNA(crRNA)以找到匹配序列 — 其为CRISPR相关(Cas)核酸酶提供特异性,以在特定 “外源” DNA序列处形成双链断裂。

CRISPR / Cas如何工作?

 


 CRISPR Cas9如何工作?

为了创建这样的工具,内源CRISPR途径被简化为两个主要组分:Cas9核酸酶和指导RNA(gRNA)1-7。指导RNA是由crRNA和tracrRNA组成的双组分系统。crRNA靶向待切割的双链DNA,并且具有短的同源区域,允许其结合tracrRNA。tracrRNA提供与Cas9蛋白结合的茎环结构。crRNA:tracrRNA双链体被称为gRNA。Cas9核酸酶和gRNA形成Cas9核糖核蛋白(RNP),其可以在整个基因组环境中结合并切割特定的DNA靶标。为了被RNP切割,靶必须具有两个特定序列。首先,gRNA需要17-21个碱基的RNA至DNA同源性,这被称为前间隔序列。其次,Cas9蛋白需要有一个短的前间隔序列邻近基序(PAM),以结合靶DNA(参见右下图1)。如果存在连接tracrRNA,并且在gRNA和基因组靶标之间存在足够的同源性,则RNP切割靶DNA的两条链,在基因组中的该精确位置处产生DSB。 

CRISPR / Cas靶向双链断裂的示意图。

图1. CRISPR / Cas靶向双链断裂的示意图。
 

虽然细胞核中的功能性CRISPR是RNP形式,但作为分子工具的CRISPR的组件适合于各种递送方法。早期实验成功地创建了嵌合单指导RNA或sgRNA,其将crRNA和tracrRNA组合成单个RNA链而不是天然存在的双链体。该sgRNA和Cas9 mRNA可以从单个质粒表达,用于直接转染或包装成用于慢病毒转导的颗粒。或者,可以将重组Cas9蛋白与合成产生的crRNA和tracrRNA组合,以产生RNP用于转染或显微注射给胚胎。

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关于Cas9蛋白的使用需要帮助吗?

靶向DSB形成后,细胞通常使用两种DNA修复途径中的一种来存活:非同源末端连接(NHEJ)或同源依赖性修复(HDR)。这些修复机制经常会出错,导致在靶位置诱变,或者通过破坏编码序列来功能性地失活或敲除基因(NHEJ),或者通过添加新的DNA序列来敲入特定的序列变化(HDR)。通过这种方式,CRISPR / Cas9系统能够对染色体DNA进行永久的、可遗传的修饰。此外,当Cas9核酸内切酶结构域失活并附着于其他效应分子以作用于基因组中的gRNA指定位点时,CRISPR系统可用作靶向递送系统。这将CRISPR系统功能扩展到基因激活和抑制。最后,CRISPR系统可用于筛选。CRISPR / Cas9系统的基因敲除、基因敲入、基因激活或抑制、以及筛选这所有四种主要用途将在下面进一步讨论。
 

 基因敲除

当与靶向基因特异的gRNA一起共表达时,CRISPR / Cas9产生敲除细胞或动物模型。基因敲除的目的是通过破坏其在细胞中的表达来揭示基因功能。共表达的适当设计的gRNA指导Cas9切割靶序列,并在目的基因中产生DSB。然后可以通过三种方式中的任何一种实现基因敲除:1)细胞通过NHEJ修复断裂,导致切割基因的开放阅读框(ORF)内的随机插入或缺失(“插入缺失”);2)细胞通过HDR从用户提供的模板修复断裂,将特定的破坏性序列插入ORF中;3)一对gRNA产生两个DSB,其位于基本编码序列的侧翼,导致其切除。

NHEJ是最活跃的修复机制,但是容易出错,并且经常引入移码,导致过早终止密码子和/或导致所得转录物成为无义介导的衰变(NMD)的靶标。移码修饰可导致过早终止密码子被引入转录物,阻止氨基酸链的关键部分被翻译,导致异常短的无功能蛋白质。无义介导的衰变通过消除含有过早终止密码子的mRNA转录物来减少基因表达中的错误。理论上,当外显子-外显子连接复合物(也就是RNA剪接期间在外显子之间的前mRNA链上形成的蛋​​白质复合物)在转录物被剪接后未被核糖体适当地去除时,这个监视途径被激活。当外显子-外显子连接复合物由于上游移码而保持结合时,转录物被指示降解,并且功能蛋白质从未被翻译。这两种途径都有效破坏细胞中的基因功能。

 基因敲入

CRISPR / Cas9也可用于引入或“敲入”新的DNA序列。常见的修饰包括引入单核苷酸多态性(SNP)、小标签、loxP或更大的基因盒,例如荧光蛋白。这些修饰是通过特定位置的Cas9诱导的DSB进行的,这显著增强了靶向整合的机会。靶向整合(基因敲入)通过HDR发生。为了通过HDR进行基因编辑,必须将含有所需序列的DNA “供体” 或修复模板与gRNA和Cas9一起递送至细胞,通常在供体质粒或寡核苷酸上。基因敲入的效率通常低于敲除(<10%的修饰等位基因),但可用于产生范围从单核苷酸变化至大插入物的特定修饰。
 

 基因激活和抑制

除了作为基因组编辑工具之外,CRISPR还可以用作其他功能蛋白的靶向递送系统。Cas9的一个独特特征是它能够独立于DNA切割而结合靶DNA,因为这是Cas9机制的两个独立步骤。野生型Cas9具有两个核酸酶结构域:RuvC和HNH。为了在没有切割的情况下实现结合,通过诱导点突变(SpCas9中的D10A和H840A)使两个核酸酶结构域失活,导致核酸酶死亡的Cas9(dCas9)。当与靶向转录起始位点的gRNA组合时,发现单独的dCas9足以通过阻断转录起始来降低或抑制转录。在这一发展之后,科学家开始尝试将转录抑制因子和激活因子与dCas9联系起来。KRAB转录抑制结构域已经与dCas9融合,作为效应结构域介导的转录沉默的模式。dCas9也与转录激活因子和转录效应蛋白融合。用于激活的dCas9是广泛流行的研究领域,并且包括诸如dCas9-VP64、dCas9_SunTag、dCas9-SAM、dCas9-RNA支架和dCas9-VPR的系统。在MilliporeSigma,我们将dCas9与人E1A相关蛋白P300的催化组蛋白乙酰转移酶(HAT)核心结构域融合。当与靶向转录起始位点和增强子区域的gRNA组合时,dCas9-P300指导组蛋白乙酰化,从其异染色状态释放DNA,以通过天然染色体环境中的内源细胞机制上调基因表达。dCas9-P300组蛋白乙酰化方法代表了相对于dCas9-VP64或其他类似基因活化基序的独特作用机制。 

DCAS9P300
 

 筛选

筛选可以快速调查大量候选基因或基因组位点,以参与您的途径或感兴趣的表型。池化寡核苷酸生产和大数据处理的改进,加上慢病毒递送的效率,使研究人员能够同时考虑数千个候选基因,无论是作为文库还是更为集中的子集(panel)。我们将文库定义为CRISPR克隆的全部基因组集合;而子集(panel)则是较小的基因子集。通常,子集(panel)和文库可以以两种形式组装:池化(在一个管中有数千个gRNA)或排列(在96孔板中每个孔一个gRNA)。这两种方法都能快速地为更大的问题提供答案,与过去的方法相比具有明显的优势,过去的老方法需要一次一个地询问候选基因,是一个费时费力的过程。

MilliporeSigma提供多种筛选解决方案,包括来自Broad的池化GeCKO文库,以及Sanger阵列全基因组慢病毒CRISPR文库,以执行大型基因敲除筛选(8)。并且,人类和小鼠CRISPR / Cas9协同激活调控子(SAM)池化文库亦即将推出,用于全基因组筛选转录激活表型!

SANGER文库

 什么是CRISPR / Cas9?

CRISPR / Cas9系统于1993年被发现,并且显示在细菌和古细菌生物体内进化,作为对病毒和外来质粒的防御。天然CRISPR途径的功能是将核酸酶靶向侵入性DNA,产生潜在致命的双链断裂(DSB)。在识别该途径的功能后不久,来自细菌化脓性链球菌(SpCas9)的II型CRISPR / Cas9系统被重新利用以产生简单但强大的分子工具,其可被编程以将核酸酶靶向特定的基因组序列。
 


 

 CRISPR配对切口酶

  • Sigma的CRISPR配对切口酶通过要求将两个单独的gRNA独立结合到局部基因组区域,进一步最小化脱靶双链断裂。
  • 在存在Cas9-D10A切口核酸酶的情况下,两个gRNA在DNA的相反链上诱导单链断裂,产生功能性双链断裂。
  • 预先设计的、独特的CRISPR配对切口酶可用于人类、小鼠和大鼠基因组的编码区域(配对切口酶预设计)。可应客户要求随时提供任何其他区域或物种的设计(参见定制CRISPR索取表)。
  • 当为特定靶订购Sigma的CRISPR配对切口酶时,研究人员将获得两个单独的即用型转染级质粒,表达来自人U6启动子的gRNA。Cas9-D10A切口核酸酶必须作为质粒或mRNA单另购买。
定制CRISPR索取表

成对的Cas9切口酶

成对的Cas9切口酶 — 为获得最佳Cas9-D10A配对切口酶功能,指导RNA应设计为5'至5'方向,PAM间距为30至150 bp。


 

 仅含纯化RNA的指导RNA

  • 适用于显微注射或细胞培养的纯化RNA形式的即用型gRNA。
  • 使用与Sigma CRISPR和CRISPR配对切口酶质粒相同的严格规则所设计。
  • CRISPR RNA格式是创建转基因动物模型的研究人员或关注基因组质粒整合的研究人员的理想选择。
  • RNA形式避免了对特定启动子的需要,允许在大多数已知细胞类型和生物体中表达。
  • 野生型Cas9CAS9P)或Cas9-D10A切口CAS9D10AP)核酸酶必须作为质粒或mRNA(CAS9MRNACAS9D10AMRNA)单另购买。
  • 可提供供体设计。

 CRISPR慢病毒

  • Sigma CRISPR慢病毒用于高效率的敲除筛选
  • 慢病毒形式允许进行CRISPR组分的有效染色体整合。
  • 使用Sigma独特的单一慢病毒CRISPR格式转导细胞,其具有侧翼为puro和GFP组件的Cas9 ORF,为监测稳定细胞群提供了多种选择。
  • 即使在难以转染的细胞中也能进行基因组编辑。
  • 从我们预先设计的CRISPR位点选择或提交定制目标。

 CRISPR慢病毒

Sigma慢病毒CRISPR:(A)全功能慢病毒CRISPR载体的载体图。(B)用通过pLV-U6g-EPCG制成的颗粒转导HEK293细胞后的GFP信号。(C)用慢病毒(pLV-U6g-EPCG)转导HeLa细胞,然后在嘌呤霉素和6TG处理上进行选择以富集HPRT1敲除。通过错配测定(CEL-I)在gRNA靶位点检测到插入和缺失。 


 CRISPR阳性和阴性对照

 CRISPR阳性和阴性对照

CRISPR01阳性对照(标为EMX1s4+Cas9的泳道)以及CRISPR02阳性对照(标为EMX1s4, EMX1as4+D10A的泳道)的凝胶 I 图像
 

 CRISPR/Cas9载体

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材料

     

阅读摘要

Bassett AR, Tibbit C, Ponting CP, Liu JL.
2014 Mar 27;6(6):1178-1179. doi: 10.1016/j.celrep.2014.03.017. Epub 2014 Mar 27.
In the Graphical Abstract and Figure 1A, the 5’ and 3’ ends of the DNA were mislabeled阅读更多
Cong L1, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F.
2013 Feb 15;339(6121):819-23. doi: 10.1126/science.1231143. Epub 2013 Jan 3.
Functional elucidation of causal genetic variants and elements requires precise genome editing technologies. The type II prokaryotic CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas adaptive immune system has been shown to facilitate RNA-guided site-specific DNA cleavage. We engineered two different type II阅读更多
Friedland AE1, Tzur YB, Esvelt KM, Colaiácovo MP, Church GM, Calarco JA.
2013 Aug;10(8):741-3. doi: 10.1038/nmeth.2532. Epub 2013 Jun 30.
We report the use of clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)-associated endonuclease Cas9 to target genomic sequences in the Caenorhabditis elegans germ line using single-guide RNAs that are expressed from a U6 small nuclear RNA promoter. Our results demonstrate that targeted, heritable genetic alter阅读更多
Hwang WY1, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK.
2013 Mar;31(3):227-9. doi: 10.1038/nbt.2501. Epub 2013 Jan 29.
In bacteria, foreign nucleic acids are silenced by clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)--CRISPR-associated (Cas) systems. Bacterial type II CRISPR systems have been adapted to create guide RNAs that direct site-specific DNA cleavage by the Cas9 endonuclease in cultured cells. Here we show that the阅读更多
Jinek M1, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E.
2012 Aug 17;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829. Epub 2012 Jun 28.
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems provide bacteria and archaea with adaptive immunity against viruses and plasmids by using CRISPR RNAs (crRNAs) to guide the silencing of invading nucleic acids. We show here that in a subset of these systems, the mature crRNA that 阅读更多
Jinek M1, East A, Cheng A, Lin S, Ma E, Doudna J.
2013 Jan 29;2:e00471. doi: 10.7554/eLife.00471.
Type II CRISPR immune systems in bacteria use a dual RNA-guided DNA endonuclease, Cas9, to cleave foreign DNA at specific sites. We show here that Cas9 assembles with hybrid guide RNAs in human cells and can induce the formation of double-strand DNA breaks (DSBs) at a site complementary to the guide RNA sequence in genomic DNA. 阅读更多
Mali P1, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM.
2013 Feb 15;339(6121):823-6. doi: 10.1126/science.1232033. Epub 2013 Jan 3.
Bacteria and archaea have evolved adaptive immune defenses, termed clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems, that use short RNA to direct degradation of foreign nucleic acids. Here, we engineer the type II bacterial CRISPR system to function with custom guide RNA (gRNA) i阅读更多
Metzakopian E1, Strong A1, Iyer V1, Hodgkins A1, Tzelepis K1, Antunes L1, Friedrich MJ1, Kang Q2,3, Davidson T2,3, Lamberth J2,3, Hoffmann C2,3, Davis GD2,3, Vassiliou GS1, Skarnes WC1, Bradley A4.
2017 May 22;7(1):2244. doi: 10.1038/s41598-017-01766-5.
CRISPR-Cas9 technology has accelerated biological research becoming routine for many laboratories. It is rapidly replacing conventional gene editing techniques and has high utility for both genome-wide and gene-focussed applications. Here we present the first individually cloned CRISPR-Cas9 genome wide arrayed sgRNA libraries co阅读更多