检测转印膜上蛋白质和核酸的方法简介

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 引言

有不同的检测方法可用来可视化转移到支撑膜上的核酸和特定蛋白质。南方和北方印迹法使用放射性探针,并在暗室里进行X光曝光或放射自显影胶片。在西方蛋白印迹法中,转印到硝酸纤维素膜上的蛋白质可用比色法、化学发光法或荧光技术检测。


 西方蛋白印迹检测法

比色检测

原理:常用的检测方法是,使用蛋白质特异性一抗,然后使用与HRP(辣根过氧化物酶)或AP(碱性磷酸酶)酶缀合的二抗进行检测。加入生色底物后,酶催化反应,并产生沉积在印迹上的有色沉淀物。这种沉淀物很容易看到,可以拍照。

膜上蛋白质的比色检测

图1. 膜上蛋白质的比色检测

 

辣根过氧化物酶(HRP)系列:与HRP相容的底物有4-氯-1-萘酚 (4-CNC8302)、3,3'-二氨基联苯胺 (DABD5905) 和 3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB; T0565)。

在过氧化氢存在下,HRP与二抗缀合

  • 将4-CN氧化成蓝紫色的4-氯-1-萘磺酸盐(naphthon)沉淀
  • 将DAB聚合成复杂的棕色沉淀物
  • 将TMB氧化成深蓝色TMB二亚胺沉淀物

碱性磷酸酶(AP)系列:与AP相容的底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP®)与氮蓝四唑(NBT) (B5655B6404B6777B1911) 的组合。

使二抗与AP缀合,从而使西方印迹上的蛋白质可见,这是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)氮蓝四唑(NBT)的两步反应的结果。AP通过去磷酸化催化溴氯吲哚基中间体的形成。NBT氧化吲哚氧基,从而产生紫色沉淀,然后它被还原成不溶的蓝色二甲沉淀物。两种沉淀物的组合在印迹上目标蛋白质所在之处有可见的紫蓝色沉淀。

 

检测方法


 

化学发光检测

原理:化学发光是物质以光的形式释放能量的一种化学反应过程。所发出的光可以在X光胶片上捕获。这是最常用的检测方法,使用二抗与HRP(辣根过氧化物酶)或AP(碱性磷酸酶)酶缀合。

用化学发光法检测膜上的蛋白质

 

图2. 用化学发光法检测膜上的蛋白质

辣根过氧化物酶-发光胺系列:发光胺是HRP的化学发光底物。在过氧化物存在下,HRP将发光胺氧化成称为3-氨基邻苯二甲酸酯的激发产物,其在425nm发射光。3-氨基邻苯二甲酸酯会一直发光,直至衰变并进入基态。所发出的光可用CCD相机或曝光X光胶片来捕获。

碱性磷酸酶(AP)-CDP-Star® 系列:CDP-Star®(2-氯-5-(4-甲氧基螺{1,2-二恶茂烷-3,2' - (5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷} -4-基)-1-苯基磷酸二钠)是AP的化学发光底物。AP将CDP-Star®去磷酸化,得到亚稳定的二恶茂烷酚盐阴离子,其在466nm处发光。发射的光线可在24小时内保持稳定,从而可以多次曝光X光胶片。 

Sigma-Aldrich提供一系列与HRP和AP酶缀合的二抗。这些二抗可以在西方蛋白印迹中与下列检测试剂一起使用。

 

产品编号 名称 相容的抗体
GERPN2124 Amersham™ ECL™ 西方蛋白印迹试剂包 HRP-标记的
GERPN2106 ECL™ 西方蛋白印迹试剂 HRP-标记的
GERPN2134 ECL™ 西方蛋白印迹试剂 HRP-标记的
GERPN2209 ECL™ 西方蛋白印迹检测试剂 HRP-标记的
GERPN2236 ECL™ Prime西方蛋白印迹检测试剂 HRP-标记的
GERPN2235 ECL™ Select西方蛋白印迹检测试剂 HRP-标记的
C0712 CDP-Star® 化学发光底物 AP-标记的


 萤光检测

原理:西方蛋白印迹上的目标蛋白质也可以使用与荧光染料缀合的一级或二级抗体进行检测。染料以特定波长发荧光,并可通过对印迹成像来检测。   
 

膜上蛋白质的荧光检测

 

图3. 膜上蛋白质的荧光检测

Sigma-Aldrich提供一系列与多种Atto荧光染料缀合的二抗。它们最适合于多重免疫印迹,其中使用与具有不同激发/发射波长的Atto染料缀合的两种二抗。用缀合了Atto染料的二抗进行多重检测最适用于检测磷酸化和非磷酸化状态的特定蛋白质。

有关多重免疫印迹的更详细信息,请单击此处


 南方和北方印迹检测方法

南方和北方印迹法使用放射性探针,并在暗室里进行X光曝光或放射自显影胶片。然而,亦可用化学发光底物来检测转移到尼龙膜上的核酸。

化学发光检测

对于核酸探针的化学发光检测,必须将膜在封闭缓冲液(B6429C7594G7663)中孵育60分钟。

HRP-发光胺系列:HRP和发光胺之间的反应也可用于检测南方和北方印迹中的核酸。可以在简单的标记反应中用HRP标记DNA和RNA探针。标记的探针可以不经进一步纯化而使用。可以通过HRP和发光胺之间的光产生反应在印迹上检测探针。

CDP-Star® 系列:可以在简单的标记反应中用含有热稳定的碱性磷酸酶的CDP-Star® 标记DNA和RNA探针。标记的探针可以不经进一步纯化而使用。杂交严格性可以通过温度和盐浓度来控制。

Sigma-Aldrich提供以下用于南方和北方印迹的化学发光检测试剂。
 

产品编号 名称 反应
GERPN2105  ECL™ 检测试剂  HRP-发光胺 
GERPN3004  ECL™ 检测试剂  HRP-发光胺 
GERPN3000  ECL™ Direct核酸  HRP-发光胺 
GERPN3001  ECL™ Direct核酸  HRP-发光胺 
GERPN3005  ECL™ Direct核酸  HRP-发光胺 
GERPN3682  CDP-Star®  AP- CDP-Star® 
GERPN3683  CDP-Star® 检测试剂  AP- CDP-Star® 


 用于检测的X光胶片

Sigma-Aldrich提供范围广泛的X光胶片,用于西方蛋白印迹上的蛋白质的化学发光检测。它们有多种不同的包装尺寸方便使用。Carestream Kodak Biomax胶卷最受欢迎的包装尺寸如下。
 

产品编号 尺寸
Z370371 8 in. (20 cm) × 10 in. (25 cm)
Z370398 5 in. (13 cm) × 7 in. (18 cm)
F5888 5 in. (13 cm) × 7 in. (18 cm)
F5763 8 in. (20 cm) × 10 in. (25 cm)


检测南方和北方印迹中的放射性探针的方法是在-80℃下用探针对X光胶片曝光。对于南方和北方印迹检测,Sigma-Aldrich提供以下不同包装尺寸的X光胶片方便使用。Carestream Kodak Biomax胶卷最受欢迎的包装尺寸如下。
 

产品编号 尺寸
Z363006 8 in. (20 cm) × 10 in. (25 cm)
Z363022 5 in. (13 cm) × 7 in. (18 cm)
Z350370 8 in. (20 cm) × 10 in. (25 cm)
Z350397 5 in. (13 cm) × 7 in. (18 cm)


 检测蛋白质和核酸的实验方案

蛋白质的显色检测

用4-CN溶液检测:

  • 西方蛋白印迹完成后,将印迹在封闭缓冲液和一抗中孵育。
  • 用HRP或AP标记的二抗孵育印迹。
  • 孵育时间取决于目标蛋白质和所用抗体浓度。
  • 将印迹置于干净、平坦的表面上。
  • 将4-CN与过氧化氢混合制成底物溶液,过氧化物终浓度为0.01%。
  • 用底物溶液均匀覆盖整个印迹表面,在室温下静置1-5分钟。
  • 当颜色强度达到要求的水平后,用水洗涤印迹以停止反应。
  • 获取印迹的图像。

使用DAB检测:

  • 西方蛋白印迹完成后,将印迹在封闭缓冲液和一抗中孵育。
  • 用HRP或AP标记的二抗孵育印迹。
  • 孵育时间取决于目标蛋白质和所用抗体浓度。
  • 将印迹置于干净、平坦的表面上。
  • 将一片DAB溶解于15 ml pH 7.6的tris缓冲盐水中制成底物溶液。使用前添加12 μL新鲜的30%过氧化氢。根据需要,可以改变DAB和过氧化物的浓度。
  • 用底物溶液均匀覆盖整个印迹表面,在室温下静置1-5分钟。
  • 当颜色强度达到要求的水平后,用水洗涤印迹以停止反应。
  • 获取印迹的图像。

使用TMB检测:

  • 西方蛋白印迹完成后,将印迹在封闭缓冲液和一抗中孵育。
  • 用HRP或AP标记的二抗孵育印迹。
  • 孵育时间取决于目标蛋白质和所用抗体浓度。
  • 将印迹置于干净、平坦的表面上。
  • 用TMB溶液均匀覆盖整个印迹表面,在室温下静置5-15分钟。
  • 当颜色强度达到要求的水平后,用高纯度水洗涤印迹以停止反应。
  • 获取印迹的图像。

使用BCIP®/NBT检测:

  • 西方蛋白印迹完成后,将印迹在封闭缓冲液和一抗中孵育。
  • 用HRP或AP标记的二抗孵育印迹。
  • 孵育时间取决于目标蛋白质和所用抗体浓度。
  • 将印迹置于干净、平坦的表面上。
  • BCIP®/NBT溶液均匀覆盖整个印迹表面,在室温下静置1-5分钟。
  • 当颜色强度达到要求的水平后,用水或1%醋酸溶液洗涤印迹以停止反应。
  • 获取印迹的图像。

蛋白质的化学发光检测

  • 西方蛋白印迹完成后,将印迹在封闭缓冲液和一抗中孵育。
  • 用HRP或AP标记的二抗孵育印迹。
  • 孵育时间取决于目标蛋白质和所用抗体浓度。
  • 将印迹置于干净、平坦的表面上。
  • 在烧杯中混合等体积的发光胺试剂和氧化剂制成化学发光试剂。将该混合物倒到印迹上面,并温和摇动孵育约1分钟。
  • 在吸墨纸上轻拍印迹,去除多余的化学发光试剂。
  • 将印迹转移到暗室。
  • 将印迹放在两层保鲜膜之间,然后放入胶片暗盒中。排出任何气泡。
  • 将X光胶片放在印迹的顶部,曝光约30秒并显影。
  • 视需要改变曝光时间以获得最佳检测结果。

核酸的化学发光检测

上述实验方案亦适用于用化学发光试剂检测南方和北方印迹上的核酸。
 

 参考文献

  • Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press, 1989.