数位聚合酶链式反应

数位PCR是终点PCR方法,其用于绝对定量和针对相似多数序列的背景分析少数序列,例如体细胞突变的定量。
 当使用该技术时,将样品用于有限稀释,并使用正反应和负反应的数量来确定目标浓度的精确测量。

数位 PCR (dPCR) 概念由 Sykes 等人于 1992 年  1   提出,然后由 Kalinina 等人于 1997 年发展成纳米级阵列格式2。持续改进 dPCR 的驱动因素之一是 Vogelstein 和 Kinzler  3   证明,在从结直肠癌患者提取的材料中可以检测和量化罕见的 KRAS 突变。Vogelstein 对患者样本进行稀释,使得达到他们预期的每 2 个反应板孔平均有 1 个模板分子。扩增突变位点周围的靶序列,然后用两个分子信标(见    定量 PCR 和数位 PCR 检测方法  )检测扩增子。第一个分子信标特异于预期不包含突变的区域,并且该测定用作 PCR 扩增阳性对照。第二个分子信标具有不同的染料标记,并且对野生型 (WT) 序列具有特异性。以这种方式,预期来自两个标记的显示阳性信号的反应是WT,而预期仅显示阳性对照的反应是突变体。由于稀释的结果,预期孔内的所有产物都是均质的,因此可以精确测量突变体与WT的比例。这些实验提供了在标准 96 孔板中进行 dPCR 的实例,但其他人提出了更高通量的选择,即 Dressman 等人   4  介绍了使用乳胶珠进行 dPCR 的概念(现在用于 Bio-Rad QX100™Digital Droplet™PCR,ddPCR™ 系统和 RainDance Technologies 的 RainDrop™ 仪器)。在另一种形式中,反应在集成的流体回路(芯片)上进行。这些芯片具有集成的腔室和阀门,用于分隔样品和反应试剂。使用芯片技术的第一个商用dPCR系统BioMark™于2006年由Fluidigm推出。

当进行常规PCR时,模板的最终浓度与起始拷贝数和扩增循环数成比例。对单个样品进行给定数量反应的实验,得出片段大小的分析,或者对于定量实时 PCR (qPCR)的分析结果,分析是基于所需循环数达到定量循环 (Cq) 的反应中目标序列浓度的估计;参见    定量 PCR 。当使用 dPCR 时,稀释样品并分离到大量的反应室中,使得每个分配包含一个或没有靶标拷贝。反应室或隔板的数量因系统而异,使用QX100 Bio-Rad系统时为数千个,使用RainDrop方法时为数百万个。然后在每个分配中进行 PCR,并使用荧光标记检测扩增子(参见    qPCR 和 dPCR 检测方法  ),使得收集的数据是一系列阳性和阴性结果。理论上,这将导致来自最初包含单个目标副本的分配的正信号和来自最初不包含模板的分配的负信号(即,无信号)。但是,由于某些分配可能包含多个模板副本,因此将样本分散到分配中视为遵循泊松分布。

理论上,dPCR可用于克服使用常规PCR时遇到的一些困难。当使用 dPCR 时,对样品进行分配,使样品中的单个核酸分子定位到许多不同的区域,因此任何目标的检测都不依赖于扩增循环的次数。一个充分优化的qPCR可以最好地区分1.5倍的变化,而据报道dPCR可以区分1.2倍的5倍的变化   5 。样品的稀释使其成为研究大多数相似但不同序列的少数序列的有用工具。例如,dPCR 可用于检测针对高浓度 WT 序列的低发生率体细胞单核苷酸多态性 (SNP)。这是因为,当稀释总样品时,稀有序列也被稀释成单一副本,因此在没有来自突出序列的竞争的情况下它将被扩增。与野生型相比,稀有 SNP 的阳性区段要少得多,因此可以对这两个序列的比值进行精确测量。

数字PCR具有许多潜在的应用,包括低水平病原体的检测和定量、稀有基因序列、副本数变异(CNV)和单细胞中的相对基因表达。通过单步dPCR实现的克隆扩增是减少许多“新一代测序”方法的时间和成本的关键因素,从而实现个体基因组学。


 仪器

虽然 dPCR 是一种相对较新的技术,但是为了提供更好的分析工具,已经开发了许多平台,例如;在不使用标准品的情况下确定绝对定量,使用多重系统检测罕见的基因突变,并在诊断样本之间确定小的倍数差异 (<1.5)。在所有平台上,dPCR 的一般概念保持不变:稀释输入DNA以产生含有1或0个副本模板的纳米级或皮质级反应。在每个含有液滴的模板内进行单独的qPCR测定,而不是合并的靶DNA群  3 。除了增加检测稀有等位基因突变和CNV测量的灵敏度之外,还可以对阳性终点反应进行绝对定量,部分原因是dPCR测量不依赖于标准曲线或样品校准。其他可归因于 dPCR 定量精密度提高的特征包括生成的可重现和均一的液滴以及分析的分配反应数量增加  6,7 。最终用户选择的仪器类型最终取决于将要执行的特定应用程序。

 

Fluidigm 公司

最早上市的 dPCR 仪器之一是 BioMark HD dPCR 系统 (Fluidigm)。该平台基于微流控芯片技术。这些芯片可以采用多种形式购买,包括12室或48室阵列。在 12 室阵列中,样品被分成 765 纳升反应,每个芯片产生 9,180 个反应。45 室阵列将样品分成 770 纳升反应,每个芯片产生 36,960 个反应。将样品装入每个室入口,并通过压力控制阀和泵分配纳升反应。样品分配和混合,以及热循环反应都是在芯片上进行的。扩增后,使用 BioMark 系统  8  捕获荧光图像。片上处理允许较少的动手操作,从而减少可能引入的错误,同时保持更简化且用户友好的系统。

Fluidigm的dPCR系统允许每个样品使用四个靶标进行多重反应。在每轮热循环之前和之后拍摄芯片的荧光图像。这样可以从最终的荧光图像中减去任何热循环前的背景,便于准确计数阳性区室。该系统的另一个特点是能够量化模板,并使用腔室特定的实时放大图划分到每个腔室中。如果dPCR不是实验室中使用的唯一应用程序,BioMark HD还可用作qPCR的兼容仪器9,10,11

 

生命技术

OpenArray®  和 QuantStudio®  12K Flex dPCR systems(生命技术)使用微流控技术生成和分析分配样本。OpenArray系统是第一个开发的系统,最多可容纳3个dPCR板。QuantStudio 12K Flex dPCR仪器最多可容纳4个dPCR板。每个384孔板有48个阵列。在每个阵列中,有64个“通孔”,每个板产生3,072个区室化反应。使用自动分配系统将纳升反应分配到“通孔”中,并通过液滴和板上涂层之间的疏水和亲水相互作用使其稳定。该平台可用于每个样品含有两个靶标的多重反应。该仪器的多功能性使其兼容 qPCR 应用  12

RainDance技术

RainDrop™仪器(RainDance技术)代表另一种高度敏感的dPCR平台。灵敏度和定量功率的增加可归因于较少的皮升反应和分配的液滴数量;每个样品约1000万个液滴。RainDrop dPCR基于液滴乳化微流体技术。芯片设计用于容纳8个样品,每个样品分成1000万个反应,每个芯片产生8000万个分配反应。由于反应分配数量的增加,可以包含更多的输入 DNA,使得该平台成为识别极其罕见突变的理想选择。随着反应次数的增加,输入 DNA 的有限稀释不再是该仪器的关注点。此外,报告表明,RainDrop系统可用于量化200,000个突变体中的1个,检测下限为每1,000,000个中检测1个。这些观察结果强调了本仪器的灵敏度  13 。除了增强的灵敏度,RainDrop 平台还可以简单地使用红色和绿色标记的荧光探针对每个样品的 5 个目标进行多重检测。用每个靶标改变荧光探针的量可产生与突变特异性双标记探针相对应的独特颜色强度(参见    定量 PCR 和数位 PCR 检测方法  ),强度与检测中使用的探针浓度直接相关。稀释荧光探针以产生光学代码的技术可以不限于5×多路复用系统,而且可以用于产生10×多路复用系统,使得该系统是最强大的dPCR多路复用系统之一14,15

虽然RainDrop是更具成本效益的平台之一,但它也不能用于qPCR应用。此外,设置为偏劳动密集型的,因此可能更容易引入错误。例如,液滴在微流体芯片中产生、收集,然后在芯片外进行热循环。然后将反应注入另一个芯片进行分析。在复用样品时,从一个芯片收集含有稀释荧光探针的液滴,并将其注入另一个芯片,使其与含有引物、主混合物和 DNA 的液滴融合。合并的液滴在芯片外被放大,然后分析是否存在所需的目标15

Bio-Rad

Bio-Rad QX100™Droplet Digital™PCR技术是唯一一个在过程的任何阶段都不使用微流体芯片的平台。取而代之的是,该仪器采用标准96孔板形式的油乳化技术。含有主混合物、引物、双标记探针和DNA的8个样品可以同时装入盒中。每个样品被放置在一个含油的井附近,并一起使用基于真空的液滴发生器进行液滴乳化。将每个样品分成20,000个反应。将液滴从8个样品盒转移到标准96孔板中。每个板可以产生总共1,920,000个液滴用于dPCR分析。将液滴转移至96孔板后,使用PCR扩增样品,使用基于流式细胞仪的液滴读取器读取终点荧光信号16,9

利用该平台产生的大量反应(每个样品 20,000 个/每个平板 190 万个)增加了
与dPCR相关的精确度,以确定绝对定量和CNV测量。与每个样品具有较少分配反应的其他系统相比,每个样品的反应数量增加提供了加载更大量模板DNA的能力。当检测到罕见的重要事件时,这会越来越有价值。也可以结合重复孔中的数字读数来确定罕见或低副本突变事件的 CNV。据报道,检测下限可以在分配反应中鉴定出 0.001% 的突变体群。Bio-Rad 的 QX100™Droplet Digital™PCR 平台还与母体血浆 DNA 一起用于确定母体和胎儿标志物的绝对定量测量值,强调了dPCR技术在测量低质量/低量模板DNA的CNV中的优势17,16。尽管QX100™Droplet Digital™PCR仪器每个平板提供大量分配反应(190万个)并且价格合理,但它与qPCR应用不兼容,并且可用于每个样品仅复用两个靶标。


 仪器限制

与qPCR相比,数位PCR具有许多优势。这些优点是通过分配单个反应实现的,从而丰富了低副本和罕见的等位基因扩增,同时由于微型反应数量的增加,提高了 dPCR 的精确度和定量能力。dPCR不仅可用于测量绝对副本数,CNV和罕见的等位基因突变,而且还可用于量化低数量/低质量DNA6,16,18,13,19,5,17。例如,当使用新一代测序时,通过 dPCR 进行定量可以避免对输入 DNA 进行滴定分析的需要和成本。这反过来又允许使用较少量的输入 DNA,最大限度地减少了对下一代测序中常用的看似有偏差的预扩增步骤的需求 7

但是,有些预扩增的情况可能是无法避免的。当处理来自单个细胞的 DNA 或当输入 DNA 已经处于低浓度时,可能需要全基因组扩增,然后将样品分成数千个反应。值得注意的是,靶DNA样品的预扩增可能导致输入DNA的偏向扩增,这有可能使dPCR结果发生偏差。因此,在评估绝对副本数之前,可能有必要检查用于该步骤的方法是否导致扩增偏差9,11。此外,已显示DNA的结构影响dPCR分析中的副本数测量。对于环化的质粒DNA尤其如此,因此在用于dPCR应用之前应该将其线性化9

dPCR 最明显的缺点之一是设备的初始成本和对消耗材料的持续需求。与此相关的是,qPCR 仪器在实验室环境中更为常见,研究人员在处理这一平台时更为简单。当然,用户所期望的应用最终将为进行这些研究所需的仪器类型提供指导。

 


 dPCR 应用

由于 dPCR 样品被分成单独的微反应器,因此分配的数量决定了检测灵敏度的范围。量化依赖于计算终点处的阳性分配的数量,而不是扩增循环,因此其不太依赖于扩增效率。为了解释目标DNA随机分布到分配中,应用泊松统计模型1 ,并计算绝对量。通常与已知量的参考序列进行比较来评估靶序列的量,以确定相对定量。用于靶DNA的绝对和相对定量的应用包括测量CNV、生物标志物分析和罕见事件的检测。另外,逆转录可以与 dPCR 结合来测量 RNA 分子。该技术有利于定量复合物中的低浓度病毒,单细胞中的转录和等位基因特异性转录。

 CNVs 是由于缺失、插入或重排导致的 DNA 异常副本,且与疾病易感性相关 20,21,22。在癌症中,基因拷贝数常常增加,患者对药物治疗的反应性与拷贝数相关23,24,25,26。许多方法已被用于量化 CNVs,包括 SNP 阵列、新一代测序和 qPCR。最近,由于副本数测定的精确度更高,dPCR 已成为量化患者生物标志物的优选工具。数位PCR已被用于准确地确定CNV,分辨率<1.25。通过添加LNA碱基增强的特异性qPCR探针(参见 定量PCR和数字PCR检测方法)可用于dPCR,以区分和检测体细胞SNP变异的存在(图4.1)。探针的设计使得突变特异性探针携带荧光团 FAM,而野生型序列 (WT) 特异性的第二个探针携带荧光团 HEX。在测定中区分WT和SNP DNA靶标。在某些情况下,基因拷贝可能在同一等位基因上“连锁”,因此 CNV 可能被低估 9。串联的基因重复可以通过用靶序列周围的特异性限制性核酸酶消化模板DNA来解决16 (图 4.2)。

用液滴数位 PCR 检测和确定 SNP 突变的相对副本数

 图 4.1. 用液滴数位 PCR 检测和确定 SNP 突变的相对副本数。制备携带荧光染料 FAM 的突变特异性探针,以及携带荧光团 HEX 的未修饰(野生型)序列的探针。X轴是HEX信号,其作为野生型序列的存在而产生。Y轴是FAM信号,其作为SNP突变序列的存在而产生。在靶DNA中检测到修饰的和野生型序列,并且可以直接确定每个序列的相对丰度。

液滴数位 PCR 分析法测定 CNV

图 4.2. 液滴数位 PCR 分析法测定 CNV。使用纯化的未消化的 DNA 作为模板来定量相对于参照的基因副本数。同样的 DNA 样品也用围绕靶序列的限制性内切酶消化以阐明靶序列的连接副本。显示泊松误差线。

数字PCR用于定量存在于丰富WT序列背景中的变体DNA序列。例如,当存在于临床样本中正常基因型的由于可用于下一代测序的 DNA 样本数量通常有限,因此样本通常通过 PCR 或全基因组扩增进行扩增。扩增后 DNA 分子的定量对测序分析的性能至关重要,可用分光光度法等方法进行。最近,dPCR 用于绝对 DNA 定量的能力已应用于下一代测序文库制备 7。开发了通用模板荧光探针PCR测定,使得在一个PCR引物的末端设计探针特异性序列用于文库扩增27。这种基于通用模板探针的测定可以与dPCR结合使用以精确定量文库分子。背景中时,可以检测到对癌症特异的体细胞突变。定量 PCR 仅限于检测 1% 或更高的突变序列。由于来自WT的分配突变体靶DNA的稀释作用,数字PCR提供了用于稀有副本的灵敏检测的工具。定量的动态范围取决于目标 DNA 的存在量和评估的分配数。可用仪器因推荐的动态范围而异。Bio-Rad QX100液滴数位PCR系统用于精确检测100,000倍WT16 的稀有突变DNA,RainDrop仪器用于检测200,000个WT拷贝的突变副本13。用于罕见事件检测的引物/探针组的典型评估包括将含有 SNP 的模板 DNA 滴定到 WT-模板 DNA 中,在每次稀释时将含有 SNP 的模板减少一半。这种实验的例子如 图4.3所示;当突变序列的频率低至约 2000 个中的 1 个时,单个孔允许检测,而相比之下,qPCR 检测限为 1/10。dPCR的检测限可以通过在多个孔中聚合数据来进一步扩展,以便在不增加含 SNP 浓度的情况下增加分配的数量。

由于可用于下一代测序的 DNA 样本数量通常有限,因此样本通常通过 PCR 或全基因组扩增进行扩增。扩增后 DNA 分子的定量对测序分析的性能至关重要,可用分光光度法等方法进行。最近,dPCR 用于绝对 DNA 定量的能力已应用于下一代测序文库制备 7。开发了通用模板荧光探针PCR测定,使得在一个PCR引物的末端设计探针特异性序列用于文库扩增27。这种基于通用模板探针的测定可以与dPCR结合使用以精确定量文库分子。

 控制细胞活性(包括细胞分化)的基因的表达在细胞群的各个成员之间变化,整个群体的测量值反映了平均值 HYPERLINK "https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/zh/technical-documents/articles/biology/digital-pcr.html" \l "ref" 28。虽然在单细胞中测定转录可能更可取,但 RNA 的存在量非常小,即<1pg29。使用qPCR进行单细胞转录组分析的常规工作流程需要预扩增步骤来扩增cDNA。由于动态范围和定量低浓度模板的能力,dPCR 是一种不使用预扩增的单细胞转录分析的合适方法。

评估液滴数字PCR测定中的引物/探针组和用于罕见事件检测的qPCR。

 图 4.3.评估液滴数字PCR测定中的引物/探针组和用于罕见事件检测的qPCR。制备携带荧光染料 FAM 的突变特异性探针,以及携带荧光团 HEX 的未修饰(野生型)序列的探针。将含有 SNP 的模板 DNA 滴定到野生型模板 DNA 中,以评估存在于丰富的野生型背景中时 SNP 突变的检测。含 SNP 的模板在每次稀释时减少一半。 A)引物/探针组用于带有突变滴定 DNA 模板的 qPCR。 B)引物/探针组用于带有突变滴定 DNA 的液滴 dPCR 的单孔中。显示了突变体与野生型副本的比例。如果突变序列的频率低至约 2000 个中的 1 个,则数位 PCR 允许检测,而 qPCR 检测限为 1 至 10。dPCR的检测限可以通过在多个孔中聚合数据来进一步扩展,以便增加分配的数量。


 数位 PCR MIQE

此前已发布“定量实时 PCR 实验发布的最低限度信息”(MIQE 指南30),以概述实验设计细节,对于qPCR结果的发表而言,该等细节被归类为必需或可取的(参见 定量 PCR)。由于添加dPCR作为新工具并引入多种dPCR仪器,因此需要开发针对dPCR的MIQE标准。已发表的数字 PCR MIQE (dMIQE) 为 dPCR 数据的有效性提出了必要和可取的考虑因素31。在许多方面,包括引物/探针设计和优化,dPCR的要求与qPCR相似。

但是,有些属性与dPCR特别相关。每个分配和分配容量的平均副本是可变的,并且这些值是准确应用泊松统计所必需的,因此应该报告。此外,必须记录从中派生结果的分配数。最好包括仪器制造商提供的分配体积方差和标准偏差。必须包括实验中使用的模板 DNA 的类型和处理。通常用限制酶预扩增或消化模板DNA。必须报告这些方法和相应的对照。需要记录优化实验,如温度梯度和循环次数测定。所需的样本量在各种仪器中是可变的,因此是适当的和可取的。正如所有已发表的报告所必需的,正反应和负反应控制以及计算的方差和置信区间是必需的。dMIQE 检查表概述了考虑因素,并将其分别指定为必要的 (E) 或理想的 (D)。

 由于 dPCR 仍然是一项相对较新的技术,因此希望尽早采用 dMIQE 指南以避免在没有适当质量和科学控制的情况下发表研究报告。


 参考

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