DNA寡核苷酸合成

亚磷酰胺化学是在20世纪80年代开发的,后来用固相支持和自动化增强,是DNA寡核苷酸制造的首选方法。与生物合成相反,化学合成按照图1中概述的步骤以3' → 5'方向进行。注意:本文专注于DNA合成(虽然类似,但与RNA的化学合成存在差异)。

固相寡核苷酸合成循环一览。在步骤1“脱三苯甲基化”中,

图1. 固相寡核苷酸合成循环一览。在步骤1“脱三苯甲基化”中,5'-DMT保护基团从第一个固相支持物连接的核苷中除去。在步骤2“偶联”中,第一个固相支持物连接的核苷的游离5'-OH攻击进入的第二核苷的磷,置换其二异丙基氨基基团。在步骤3“氧化”中,不稳定的亚磷酸三酯被转化为稳定的磷酸三酯,这允许开始下一循环,在步骤1中进行第二个核苷的脱三苯甲基化。然而,在进入下一个循环之前,在步骤4“加帽”中,将具有未反应的5'-OH的固体支持物连接的核苷乙酰化,从而防止具有缺失突变的序列延长(在氧化后进行加帽以驱除所有的水,否则会抑制下一个反应循环)。 

 

 亚磷酰胺法

本节探讨亚磷酰胺方法中四个步骤 [步骤1(脱三苯甲基化),步骤2(偶联),步骤3(加帽)和步骤4(氧化)] 中每一步的详细化学过程。

步骤1:脱三苯甲基化

通过除去固相支持物连接的核苷(含有寡核苷酸的末端3'碱基)的5'-DMT(4,4'-二甲氧基三苯甲基)保护基团来引发该循环。5'-DMT在固相支持树脂的官能化过程中防止核苷聚合。该机制如图2所示。

脱三苯甲基化机制

图2. 脱三苯甲基化机制。5'-DMT保护基团通过TCA(三氯乙酸)在溶剂二氯甲烷中除去(太浓缩的TCA溶液或太长的脱三苯甲基化时间会导致脱嘌呤,因而会降低最终寡核苷酸的总产率)。产物包括具有游离5'-OH和DMT碳阳离子的3'末端核苷(通过图中未显示的电子离域形成的共振结构)。核苷在合成中进行到步骤2,而DMT碳阳离子在495nm处吸收,从而产生可用于监测偶联效率的橙色。

 

步骤2:偶联

一旦除去DMT,固相支持物连接的核苷的游离5'-OH能够与下一个核苷反应,其以亚磷酰胺单体加入。该机制如图3所示。

偶联机制

图3. 偶联机制。溶剂乙腈中进入的亚磷酰胺单体的二异丙基氨基基团被酸性催化剂ETT [5-(乙硫基)-1H-四唑] “活化”(质子化)。当试剂被输送到固相支持物时,在合成仪的流体管线中进行混合。活化的亚磷酰胺以多倍于固相支持物连接的核苷的量加入,以使反应尽可能接近完成。产物包括具有亚磷酸三酯键的二核苷和游离的二异丙氨基基团。

 

步骤3:氧化

在偶联反应过程中形成的亚磷酸三酯是不天然且不稳定的;因此,必须在下一个循环开始之前将其转化为更稳定的磷物种。氧化将亚磷酸三酯转化为稳定的磷酸三酯。该机制如图4所示。

氧化机制

图4. 氧化机制。在水和吡啶存在下用碘实现亚磷酸三酯的氧化。产物是磷酸三酯,其基本上是标准DNA骨架,在游离氧上具有β-氰乙基保护基团。

 

步骤4:加帽

由于100%的偶联效率是不可能的,因此总会存在一些与未反应的5'-OH连接的固相支持物连接的核苷。如果没有被封闭,这些羟基基团将在下一个循环中反应,从而导致缺失碱基。由连续循环积累起来的这些缺失突变将产生难以纯化的“短链”的复杂混合物,因此可能使寡核苷酸在随后的应用中无用。需要进行加帽步骤以防积累短链。该机制如图5所示。

氧化机制

图5. 加帽机制。乙酸酐和N-甲基咪唑反应,在含有少量吡啶的溶剂四氢呋喃中形​​成中间体。当试剂被输送到固相支持物时,在合成仪的流体管线中进行混合。产物是固相支持物连接的核苷,其具有乙酰化的5'-OH(吡啶保持碱性pH,从而防止游离乙酸盐/乙酸使亚磷酰胺单体脱三苯甲基化)。

连续循环

第二个循环从步骤1“脱三苯甲基化”开始,然后是其余的三个步骤。重复的循环次数等于所需的碱基数。我们合成2到120个碱基的寡核苷酸。 

 

 切割

我们专有的固相支持物 / 接头对所有亚磷酰胺试剂都是稳定的,但在合成结束时可从寡核苷酸中切割下来。切割是必要的,以便游离的3'-OH可以参与生化反应,例如当寡核苷酸用作引物时,在PCR期间通过DNA聚合酶延伸。反应物和产物如图6所示。

切割的反应物和产物

图6. 切割的反应物和产物。通过用浓氨水处理来进行接头的酯水解(同时除去固相支持物)。产物是具有游离3'-OH末端的寡核苷酸。

 

 脱保护

切割后,加热寡核苷酸的浓氨水溶液,以从碱和磷酸盐中除去保护基团。

碱基

胸腺嘧啶不需要保护基团,但腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤需要,因为它们含有环外伯氨基。必须除去保护基团,以便可以形成寡核苷酸与靶核酸之间的适当氢键。反应物和产物如图7所示。

碱脱保护的反应物和产物

图7. 碱脱保护的反应物和产物。加热寡核苷酸浓氨水溶液。保护基团包括:N(6)-苯甲酰基A,N(4)-苯甲酰基C和N(2)-异丁酰基G。反应产物是完全去保护的A、C和G碱基。

除了标准保护基团之外,不稳定的二甲基甲酰胺基G和“超温和”保护基团可用于对氨敏感的修饰寡核苷酸。相关碱基上的这些保护基团如图8所示。

 

不稳定的和超温和的保护基团

图8. 不稳定的和超温和的保护基团。二甲基甲酰胺基保护基团通常通过加热在浓氨水中除去,但是比异丁酰基的时间短得多。超温和保护基团包括:N(6)-苯氧基乙酰基A,N(2)-乙酰基C和N(2)-异丙基苯氧基乙酰基G。它们通常在室温下在浓氨水 / 甲胺溶液中除去。

 

磷酸二酯的形成

必须除去磷酸盐游离氧上的β-氰乙基基团,以将其从磷酸三酯转化为磷酸二酯。该机制如图9所示。

通过去保护形成磷酸二酯的机制

图9. 通过去保护形成磷酸二酯的机制。用β-消除法在浓氨水中除去氰乙基基团。这个反应很快,因为与吸电子氰基相邻的碳上的氢原子是高度酸性的。产物是具有天然磷酸二酯骨架和丙烯腈的寡核苷酸。

 

 产率

合成的产率很大程度上取决于偶联效率。即使我们很容易实现99.5%的效率,但您可以在表1中看到,随着寡核苷酸长度的增加,产率迅速降低。

表1. 产率、长度与偶联效率。产率与长度的关系可通过耦合效率使用下式确定:Y=CEN  [此公式用于我们使用的通用支持物;否则,对于碱基特异性支持物,Y = CEN-1(Y = 产率,CE = 偶联效率,N =寡核苷酸长度)]。即使在99.5%的偶联效率下,实际合成长度通常限制在120碱基以下,以实现不低于50%的产率。 

 

长度(碱基数) 偶联效率
  90.00% 95.00% 97.00% 98.50% 99.50%
10 34.90% 59.90% 73.70% 86.00% 95.10%
20 12.20% 35.80% 54.40% 73.90% 90.50%
50 0.52% 7.70% 21.80% 47.00% 77.80%
100 0% 0.59% 4.80% 22.10% 60.60%
150 0% 0% 1.00% 10.40% 47.10%
200 0% 0% 0.23% 4.90% 36.70%

重要的是要记住,偶联效率并不是决定产率的全部因素。脱保护、切割和纯化(甚至简单的脱盐)都会进一步降低产率。可以在此处找到我们基于生产规模和纯化的保证产率。

 

材料