寡核苷酸的操作处理和稳定性

DNA寡核苷酸是相对稳定的分子(表1)。但是,它们需要一定的操作处理和储存技术,以确保无故障实验和最大限度地延长保质期。

表1. 在适当储存条件下,未修饰的单链DNA寡核苷酸的大致保质期。这些值是估计值,不能保证。如想获得实验确定的有保证的保质期,请通过dnaoligos@sial.com了解相关的稳定性研究(见下文)。

条件 保质期
-20°C(冻箱) 稳定约2年,无论是干燥形式还是溶液(水或TE缓冲液)
4°C(冰箱) 稳定约1年,无论是干燥形式还是溶液(水或TE缓冲液)
室温 稳定约3-6个月,无论是干燥形式还是在TE缓冲液中
热天(无温度控制的运输途中或储存于仓库中) 稳定约1-2个月,无论是干燥形式还是在TE缓冲液中

 

 重悬、储存和工作习惯

未修饰的DNA

重悬。除非要求在溶液中运输,否则所有单链DNA寡核苷酸都是以干燥形式运输的,只需重悬即可使用,但硫醇修饰的序列除外(请遵循还原实验方案活化这些寡核苷酸)。优选弱缓冲液,例如TE(10 mM Tris,pH 7.5至8.0,1 mM EDTA)或Tris(10 mM Tris-HCl,pH 8.0),其中TE是最佳选择。如果TE不适合最终技术 / 应用,那么无菌,无核酸酶的水是第二个最佳选择。

储存。如表1所示,在-20℃下储存时具有最长保质期。TE缓冲液绝对是最佳选择,因为实验室级水通常是微酸性的,会缓慢降解DNA。此外,干燥的寡核苷酸也永远不是真正干燥的。总会保留一些水分,因此这会导致缓慢降解。然而,无论是干燥的还是在水中或缓冲液中,至少在2年内稳定性都不太可能有任何显著变化。

未修饰的RNA

重悬。单链RNA寡核苷酸应按照上文所述对未修饰DNA的重悬方法重悬。

储存。由于其化学结构,RNA不如DNA稳定。RNA容易自催化(图1)和被RNase降解,实验室中到处存在RNase,因为它们存在于脱落的皮肤细胞和普遍存在的微生物等来源中。

RNA自催化

图1. RNA自催化。RNA的2'-羟基可导致自催化降解,继而在合适条件下降低有用的寡核苷酸的量。
 

对于短期储存,单链RNA寡核苷酸应储存于-80°C下TE缓冲液中。如要长期储存,最好以乙醇沉淀物的形式储存于-80°C下。采取预防措施尽量避免接触RNases可延长保质期。

使用RNA。RNase通常含有许多二硫键,因此非常稳定。这些酶能抵抗常规消毒方法,例如高压灭菌,因此必须用强化学品才能清除。以下预防措施将有助于最大限度地减少RNA寡核苷酸暴露于RNase:

  • 相信工作区 / 实验室中的所有东西都可能存在RNases污染。
  • 在实验室中专门隔离一个区域只处理RNA。
  • 定期用杀灭RNases的药剂清洁RNA隔离区。
  • 使用经认证不含RNase的化学品、试剂和水。
  • 使用RNA专用工具,例如微量移液管。
  • 始终戴着手套,当接触其他表面后务必更换。

修饰的寡核苷酸

重悬。修饰的寡核苷酸,无论是DNA还是RNA,都应重悬于TE缓冲液中。这十分重要,特别是对于荧光基团,因为pH会对荧光发射强度产生很大影响。

储存。修饰的寡核苷酸的稳定性特征应与其所对应的未修饰的DNA和RNA相似。因此,应根据上述对DNA和RNA的建议进行储存。为防止曝光,荧光标记的寡核苷酸应避光保存。

使用荧光修饰。在使用荧光基团时为防止曝光,须将它们置于琥珀色管中,或者用箔包裹的透明管中。

双链寡核苷酸

我们的科学家发现siRNA双链体的干燥形式在-20°C下可保存至少3年。DNA双链体如果不是比这更稳定也应该同样稳定(该值只是估计值,不能保证。如想获得有保证的实验确定的有效期,请通过dnaoligos@sial.com了解相关的稳定性研究 [见下文])。

一次性等分试样

虽然反复冻融被认为会降解基因组DNA,可能是由于冰晶形成导致的剪切作用1,但我们的科学家们发现寡核苷酸不受这些循环的负面影响。然而,将寡核苷酸等分成一次性等分试样,然后冷冻保存在-20℃下,仍然是最好的做法。这可以防止因交叉污染或泼洒等事故造成的浪费。例如,如果一管寡核苷酸洒到地板上,就得重新订购。然而,如果只是洒了一个等分试样,只需再解冻一支就行了。

 

 制备溶液

试管标签和技术数据表上的寡核苷酸数量使用多种单位,包括光密度(OD)、微克(μg或者μg/OD)和纳摩尔(nmol)。我们的定量方法最开始用UV / Vis分光光度计读取260 nm处的吸光度以提供OD值 — 然后从OD值得出所有其他单位值(详情请见寡核苷酸定量)。这些数量单位均可直接用于制备原液,但其中nmol是最有用的。

有许多浓度单位,但微摩尔(μM)可能是寡核苷酸最常用的单位。在这里,作为一个示例,我们将从试管标签 / 技术数据表中给出的nmol数量开始,用详细步骤和快捷公式计算出制备100 μM原液以及10 μM工作溶液所需的量。如想更快算出结果,包括其他单位的浓度的计算,请使用OligoEvaluator的重悬和稀释模块。

重悬的详细步计算示例

在尺寸计算时,为了避免换算混淆,我们使用基本单位。直接在nmol、μM和其他非基本单位之间进行换算很容易出错。

步骤1. 将试管标签 / 技术数据表上的nmol数换算为摩尔数。

我们假设的寡核苷酸数量为49.9 nmol。

 

 

步骤2. 将所需的100 μM原液浓度换算为摩尔浓度。

 

步骤3. 使用所需原液的摩尔浓度以及摩尔数来计算重悬所需的体积升数。

 

步骤4. 将升换算为微升(μL)。

 

重悬的快捷计算示例

步骤1. 从试管标签 / 技术数据表中读取nmol量,然后乘以10,得到重悬体积的微升数。

 

此快捷计算只用于制备100 µM溶液。

在本例中,向含有寡核苷酸的试管中加入499 μL水或缓冲液,然后涡旋以确保充分混合。

关于重悬的补充说明

上述重悬示例中使用了100 μM,因为它是典型的实验室原液浓度。如果制备的原液浓度远低于100 μM,则可能会有问题,因为这样会使重悬所需的体积很容易超过试管的2 mL容量。例如,如要制备示例中的这种寡核苷酸(49.9 nmol)的20 μM原液,则需要添加2.49 mL水或缓冲液。

同样,如果制备浓度高于100 μM的原液也有问题。例如,如要制备示例中的这种寡核苷酸的1000 μM原液,则需要添加49.9 µL水或缓冲液。从2 mL试管中精确移液这么小的体积会很困难。

如果制备100 μM的原液,实际上都不需要计算,也不需要在线工具,因为技术数据表上就给出了重悬所需的量。

工作溶液计算的示例

在这个示例中,我们假设最终的10 μM工作溶液的体积为20 μL,这个是PCR所用的典型体积。

步骤1. 使用浓度体积公式。

在本示例中,将2 μL原液加入到反应管中,并与其他组分一起,用水或缓冲液定容至20 μL。

 

数量验证

我们非常注意确保OD值准确。但您可能仍需验证寡核苷酸的数量。在这种情况下,如果您有传统的紫外/可见分光光度计,方法应很简单。

执行下列步骤:

  1. 将寡核苷酸重悬于400 μL水或缓冲液中。
  2. 将12 μL稀释到988 μL无菌、无核酸酶的水中。
  3. 读取比色皿中1 mL样品的A260读数。
  4. 确保OD值在线性范围内(~0.1至1 OD)。
  5. 将样品体积的OD乘以稀释因子。
  6. 将总OD乘以μg/OD(来自技术数据表)得到μg。 

 稳定性研究

鉴于每种寡核苷酸都是定制的,因而是独特的,因此未经实验确定,不可能提供有保证的保质期。然而,表1中的保质期估计值对大多数研究人员来说应作用良好。

但是如果您正在开发用于商业化的含寡核苷酸的产品(生命科学研究工具、分子诊断或实验室开发的测试),您可能需要有保证的保质期。在这种情况下,我们建议进行稳定性研究。您可以选择实时或加速项目。

实时项目需要等待寡核苷酸自然降解。鉴于寡核苷酸非常稳定,几乎没有人愿意等这么长时间(许多年),因此基本上是不可行的选择。因此,我们建议采取加速项目,通常只需10周。

如果您有兴趣进行稳定性研究,请联系dnaoligos@sial.com

 

 结论

即使处理不当,大多数单链DNA寡核苷酸也足够稳定,具有良好功能,只要在到货后短期内使用。如果需要其他帮助,请咨询我们的技术服务组:oligotechserv@sial.com

 

 材料

     

 参考

  1. Roder B, Fruhwirth K, Vogl C, Wagner M, & Rossmanith P (2010). Impact of Long-Term Storage on Stability of Standard DNA for Nucleic Acid-Based Methods. J Clin Microbiol, 48, 4260-4262.