锁定核酸® (LNA®)

寡核苷酸中无qPCR 探针的锁核苷酸在除了美国以外的地区均可购得。

LNA是一种新型核酸类似物,含有2'-O,4'-C亚甲基桥(图1)。这种桥接锁定在3'-内构象中,限制了呋喃核糖环的灵活性,并将结构锁定为刚性双环形式。这意味着更强的分析性能和更广泛的应用。

 LNA和天然状态DNA单体的结构。

图1. LNA和天然状态DNA单体的结构。

LNA qPCR探针可溶于水和标准缓冲液,并遵循Watson-Crick碱基配对规则1
 

 优点

当LNA被掺入qPCR探针时,与天然状态DNA碱基相比,它具有多种优势,包括:

  • 热稳定性和杂交特异性更高
  • 基因定量和等位基因鉴别更准确
  • 针对有问题的靶序列,探针设计更容易、更灵活

热稳定性和杂交特异性更高

将LNA掺入qPCR探针可提高双链体热稳定性2,并提高探针与靶序列杂交的特异性3
 这减少了来自伪结合的背景荧光,从而提高了信噪比。
 此外,与天然状态DNA qPCR探针相比,LNA探针与其靶标的杂交得到改善,在培养基盐条件下,每取代一个LNA单体,解链温度(Tm)提高多达8℃(表14。杂交的这种增加大大拓宽了测定条件范围,实现更成功的多重测定5

表1. 增加qPCR探针中LNA碱基的数量会提高Tm
 

探针序列 LNA碱基 Tm* ΔTm ΔTm/LNA
GTGATATGC 0 29 °C  
GTGATATGC 3 44 °C 15 °C +5 °C
GTGATATGC 9 64 °C 35 °C +3.9 °C

* 探针与其互补序列之间的双链TM
粗体和下划线的碱基表示LNA碱基。

基因定量和等位基因鉴别更准确

掺入LNA碱基后,qPCR探针通过SNP区分等位基因的能力大大增强(图26-8。与天然状态DNA qPCR探针相比,单碱基错配的存在对LNA qPCR探针与其靶标之间的双链体形成具有更大的去稳定作用。掺入LNA碱基的较短qPCR探针可以在与较长天然状态DNA qPCR探针相同的温度下使用。

基因定量和等位基因鉴别更准确

图2. LNA双标记探针在SNP基因分型分析中比DNA双标记探针具有更好区分能力9粉色)用LNA突变探针(具有3个LNA碱基的16聚体)进行突变DNA分析。绿色)用天然状态DNA突变探针(25聚体)进行突变DNA分析。红色)具有天然状态DNA突变探针(25聚体)的野生型DNA。紫色)具有LNA突变探针(具有3个LNA碱基的16聚体)的野生型DNA。

针对有问题的靶序列,探针设计更容易、更灵活

由于LNA的杂交特征改善,并伴随着Tm增加,LNA qPCR探针可以被合成得更短,这克服了天然状态DNA qPCR探针存在的某些设计限制。具体而言,可以设计LNA qPCR探针来解决传统上有问题的靶序列,例如富含AT或GC的区域。例如,富含AT的天然状态DNA qPCR探针通常需要超过30个碱基(有时超过40个碱基)以满足扩增子设计指南,但仍可能表现不佳。使用LNA qPCR探针,LNA碱基的选择性放置有助于优化设计高度特异性、较短的qPCR探针,即使仅有13至20个碱基,也能表现良好。此外,LNA极大地促进了用于靶向困难SNP的qPCR探针的设计,例如相对稳定的G:T错配。

其他优点

LNA qPCR探针与所有实时热循环仪和终点分析检测仪器​​兼容。不需要专门的工具。
 

 应用

LNA可以掺入所有可用的qPCR检测化学品,包括:

  • 双标记探针
  • Molecular Beacons
  • LightCycler®探针
  • Scorpions®探针

并且,可用于以下应用:

  • SNP检测
  • 等位基因鉴别
  • 病原体检测
  • 多重测定(Multiplexing)
  • 病毒含量定量
  • 基因表达分析
  • 基因拷贝测定

 结论

LNA在许多应用中提高了qPCR探针的性能。网上设计选择以及设计咨询均可用。如果需要其他帮助,请咨询我们的技术服务组:oligotechserv@sial.com
 

 材料