新型无异种和无血清成骨分化培养基中人间充质干细胞的加速骨细胞分化

作者:Anna Abai, Nick Asbrock and Vi Chu1
1 MilliporeSigma, Bioscience Division, Temecula, CA, USA


 引言

间充质干细胞(MSC)具有多谱系分化的能力,产生多种间充质表型,例如成骨细胞(骨)、脂肪细胞(脂肪)和软骨细胞(软骨)。MSC衍生的成骨细胞还可以用于修复骨折,生成干细胞衍生的骨移植物,以及融合脊柱。从hMSC生成成骨细胞,在开发和评估用于减轻整形外科疾病的药物方面具有巨大价值。类似地,从iPSC产生MSC的能力使得产生疾病特异性MSC成为可能,这可能将有助于监测整形外科疾病进展,检查药物的治疗功效。

在指导MSC和其他干细胞产生功能完整的特定细胞类型中所存在的困难,阻碍了充分利用这些多能和多功效细胞的巨大潜力。以可再现且成本有效的方式大规模生产特定类型的细胞更是困难重重。这里要考虑的主要因素之一是对特定细胞培养基的需求,这类培养基应该消除了可变因素,且不含动物衍生成分。这对于成骨细胞生产尤其重要,因为成骨分化实验方案总是包含血清,而血清里含有产生这些细胞所必需的组分。

为了克服这些困难,我们与Plasticell有限公司合作开发了OsteoMAX-XF™ 分化培养基:它是一种新型无血清、无异种分化培养基,用于从人类MSC生成成骨细胞,加速分化率和频率。通过筛选大约3,500种不含血清和异种的培养基的组合,我们发现了一种非常有效、成份完全已知、可再现的培养基,可促进hMSC向成骨细胞的分化,为多种应用提供了生产大量人骨细胞的一种卓越而经济的方法

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 方法

使用Plasticell的Combicult® 高通量组合平台使得OsteoMAX-XF™ 分化培养基的发现成为可能。该平台包括缩微到微载体珠子上细胞培养物、汇集/分离方案、以及独特的标记系统,一次筛选操作可同时完成数千个实验(图1)。在该系统中,在微载体珠上生长的干细胞,被随机打乱分离到多种分化培养基中,然后再汇集在一起。这样的分离、培养、汇集过程系统性地重复进行,在一个预定的基质中含有培养基所有可能的组合。每种培养基都掺有独特的荧光标签,附着在珠子上。在分化过程结束时,通过筛选测定(例如免疫染色或报告基因表达测定法),即可鉴定出带有分化细胞​​的珠子。使用自动化的大颗粒分选器分离各个阳性珠子。然后通过分析附着于珠子的荧光标记推断出每个阳性珠子的细胞培养历史。通常,在每次筛选中会发现100个或更多个阳性分化方案。然后使用定制的Ariadne® 生物信息学软件对它们进行分析,该软件使用分级群聚和概率分析等标准来选择用于进一步验证的最佳方案。

图1. Combies® 筛选设计。这样的分离、培养、汇集过程系统性地重复进行,在一个预定的基质中含有培养基所有可能的组合

图1. Combies® 筛选设计。这样的分离、培养、汇集过程系统性地重复进行,在一个预定的基质中含有培养基所有可能的组合。

我们在3个分化阶段的每一个阶段将细胞筛选到15种不同的无血清培养基中,因此共测试了3,375种独特的分化方案。在每次实验结束时,分析珠子上表达骨钙蛋白(一种成骨细胞标记物)的细胞。我们发现97个独特的方案,使用生物信息学软件进行分析,帮助我们识别出那些预计最有效和最优的方案。其中,12个被选择用于验证研究,并且在单层培养系统中用筛选实验中所使用的微载体珠进行了测试。从这些验证实验中,确定了最有效的方案B372。具体而言,与其他选择的方案相比,该方案给出了非常广泛的培养物矿化。

下一步是优化方案B372以及实验室和更大规模使用的配方。我们发现,将来自3个分化阶段的培养基组分混合到一个配方中,提供了比串行方案更有效的分化。这种“一次应用”制剂被称为B372+(现在商业上称为OsteoMAX-XF TMSCM121),它在几种MSC来源都进行了测试,并与其他市售的成骨分化试剂盒进行了比较。

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 结果

通过CombiCult® 技术确定的无血清分化方案的验证和改进,帮助发现了促进MSC分化为矿化骨细胞的方案。该新方案比市售试剂盒更有效,并且在多种细胞系中提供一致的结果。分化后MSC培养物的茜素红染色28天;细胞系1-3:骨髓来源的MSC;细胞系4:脂肪来源的MSC。

图2. 通过CombiCult® 技术确定的无血清分化方案的验证和改进,帮助发现了促进MSC分化为矿化骨细胞的方案。该新方案比市售试剂盒更有效,并且在多种细胞系中提供一致的结果。分化后MSC培养物的茜素红染色28天;细胞系1-3:骨髓来源的MSC;细胞系4:脂肪来源的MSC。

 

使用(i)OsteoMAX-XF TM 分化培养基(ii)供应商LT成骨分化试剂盒,分化多个MSC细胞系。图中给出的是四种不同的人MSC细胞系,在48孔板培养板培养物中诱导分化超过21天的情况。图中显示了在第7、14和21天茜素红染色具有代表性的孔。

在OsteoMAX-XF TM 培养基中分化的人骨髓衍生的MSC(SCC034)的矿化动力学图像。

 

图3. (A)使用(i)OsteoMAX-XF TM 分化培养基(ii)供应商LT成骨分化试剂盒,分化多个MSC细胞系。图中给出的是四种不同的人MSC细胞系,在48孔板培养板培养物中诱导分化超过21天的情况。图中显示了在第7、14和21天茜素红染色具有代表性的孔。(B)在OsteoMAX-XF TM 培养基中分化的人骨髓衍生的MSC(SCC034)的矿化动力学图像。
 

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使用OsteoMAX-XF TM 分化培养基对骨髓MSC细胞系进行的大规模骨细胞分化在分化10天后用茜素红矿物染色(TMS-008)的情况。从600 cm2细胞培养瓶或500 cm2滚瓶中可以获得大约107个矿化成骨细胞。

 

图4. 使用OsteoMAX-XF TM 分化培养基对骨髓MSC细胞系进行的大规模骨细胞分化在分化10天后用茜素红矿物染色(TMS-008)的情况。从600 cm2细胞培养瓶或500 cm2滚瓶中可以获得大约107个矿化成骨细胞。 

对OsteoMAX-XF™ 稳定性进行的碱性磷酸酶定量测定。使OsteoMAXTM 培养基经受24小时室温至7天37℃范围的应激条件。将细胞暴露于不同浓度的应激补剂7天,然后收集调节过的培养基,用于定量测定AP活性。我们使用了我们的定量碱性磷酸酶ES表征试剂盒(SCR066)

图5. 对OsteoMAX-XF™ 稳定性进行的碱性磷酸酶定量测定。使OsteoMAXTM 培养基经受24小时室温至7天37℃范围的应激条件。将细胞暴露于不同浓度的应激补剂7天,然后收集调节过的培养基,用于定量测定AP活性。我们使用了我们的定量碱性磷酸酶ES表征试剂盒(SCR066)。应激条件为:#1:一次冻融循环(对照);#2:两次冻融循环;#3:两次冻融循环,置于室温下24小时;#4:两次冻融循环,置于室温下2天;#5:两次冻融循环,置于室温下3天;#6:两次冻融循环,置于室温下4天;#7:两次冻融循环,置于室温下6天;#8:两次冻融循环,置于室温下8天;#9:两次冻融循环,置于37℃下7天。


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 结论

我们描述了一种新型、无血清、无异种MSC成骨分化培养基的发现和商业开发。该配方极为有效,在7天内产生矿化培养物,并且在所有受测的MSC中均同样有效,包括源自多能干细胞的那些细胞。这对于产生用于药物筛选的自体疗法或疾病和患者特异性细胞尤其重要。分化规模可以缩放,能生成大规模应用所需的细胞数。OsteoMAX-XF™ 培养基为研究、临床和药物开发应用提供了一种生成人成骨细胞的可靠、简单、经济的方法。


 材料