MISSION® TRC3人ORF系列

我们的即用型MISSION® TRC3开放阅读框(ORF)克隆,凭借我们一流的制造技术,可用来在难以转染的细胞系中实现稳定整合、细胞富集和长期基因表达。该系列为研究人员提供了独特的工具,通过调节基因和蛋白质表达来深入探索基因功能。MISSION® TRC3 ORF系列包含33,000多个预克隆的ORF,涵盖14,000多个人类基因。

无论是进行基因过表达研究,还是验证RNAi / CRISPR实验所得到的基因敲减/敲除结果,TRC3 ORF都是蛋白质表达和基因分析的理想捷径。研究人员经常需要从遗传筛选中验证“命中”情况,以消除脱靶造成的假阳性结果。验证过程旨在确认所观察到的表型是由于目标靶基因的敲低/敲除造成的。通过ORF过表达来重新表达目的基因,是鉴定表型变化是真实命中的结果还是由于脱靶效应引起的结果的最佳和最为人所接受的方式。


 什么是ORF?

开放阅读框(ORF)是一个DNA序列,它始于起始甲硫氨酸密码子ATG,终于三个终止密码子TAA、TAG或TGA之一。该序列分别被转录和翻译成信使RNA和蛋白质。虽然编码基因的基因组序列包括内含子(未翻译)和外显子(已翻译)序列,以及5'和3'未翻译调节区(UTR),但ORF仅包含已翻译基因的密码子序列。ORF通常也称为CoDing序列(CDS),因为它仅包括已被翻译的密码子而没有调节序列。通常将ORF插入表达质粒(含有启动子)中,并转导到细胞中,以研究相应的基因和蛋白质功能。ORF在RNAi 和CRISPR拯救实验中也发挥重要作用,在这类实验中,基因表达在基因消融后恢复(获得功能)用于表型验证。


 MISSION® TRC3人ORF系列

MISSION® TRC3人ORF系列全面包括所有完全测序的ORF,包装在2种不同的Gateway适应载体中:入门载体和嘌呤霉素载体。所有入门载体克隆都有细菌甘油原液和质粒DNA形式。所有嘌呤霉素载体克隆都有细菌甘油原液、质粒DNA和慢病毒颗粒形式。

我们供应33,000多种预克隆的人ORF构建体,其靶向14,000多种可用于过表达或拯救/验证实验的人基因。我们的产品系列包含独有的嘌呤霉素文库和扩展的人ORFeome v8.1入门文库(Yang et al 2011)。

我们的ORF表达载体系统允许用额外的肽序列或标签来修饰天然蛋白质的性质。亲和标签可用于纯化蛋白质,以用于进一步的结构和表征研究。表位标签(例如在嘌呤霉素载体中发现的V5,或从入门载体亚克隆时选择的标签)允许通过抗体进行简单的检测或纯化。添加报告子和荧光标签还可进行基因表达监测和细胞定位。

 

Gateway®克隆系统(Invitrogen)可用来在含有'Gateway att'侧翼位点的质粒之间转移DNA片段。通过将目标DNA片段 / 基因插入质粒中”att“侧翼重复序列之间来制备”Gateway入门克隆“。

 

图1. Gateway®克隆系统(Invitrogen)可用来在含有'Gateway att'侧翼位点的质粒之间转移DNA片段。通过将目标DNA片段 / 基因插入质粒中”att“侧翼重复序列之间来制备”Gateway入门克隆“。

来自Gateway入门克隆的目标基因可以被转移至任何Gateway目的地载体(其包含”att“粘性末端、启动子、表位标签、选择标记),以产生用于进一步应用的”表达克隆“。

 

人ORFeome v8.1文库(入门文库)

  • 通过调整Gateway克隆系统,将完全测序的ORF从哺乳动物基因系列(MGC)cDNA转移到重组入门载体pDONR223中,即可创建入门文库。
  • 该文库用于需要将ORF快速穿梭至任何可兼容Gateway®的表达载体的应用中。
  • 天然终止密码子被省却,且被三种终止密码子(TAA、TAG或TGA)之一取代。
  • 没有上游启动子,因此不能用于表达研究(除非亚克隆到表达载体中)。
  • TRC3入门系列包括来自hORFeome v8.1文库的扩展基因和克隆内容,将覆盖范围增加至多达14,000个人类基因(16,000多个克隆)。
  • 能轻松、高效地转移到任何经Gateway适应的表达载体,含有不同的启动子、选择标记、荧光团、tet诱导性等。
  • 该文库不具有慢病毒格式,因为它缺乏病毒包装所必需的慢病毒成分。它有细菌甘油原液和质粒DNA形式。
pDONR223载体示意图及功能"
 
图2. pDONR223载体示意图及功能
 
 
载体标签 功能
att Gateway重组位点
ORF 开放阅读框插件
pUC ori 大肠杆菌中的高拷贝复制和维持

Spcr 壮观霉素抗性基因

嘌呤霉素ORF文库

  • 该文库包含17,000多种人ORF。
  • ORF已预先克隆,是即用型产品,用于哺乳动物细胞表达。
  • 表达就绪载体具有驱动ORF表达的EF1-α启动子,对于CMV启动子被关闭或甲基化的一些细胞类型(例如原代细胞)而言,ORF表达是优选的。
  • 5' V5表位可用于蛋白质纯化或共沉淀研究。
  • PAC(嘌呤霉素抗性基因)用作选择性标记。
  • ORF文库是Sigma-Aldrich独有的。
  • 汇集筛选应用:包含24核苷酸条形码序列,该序列位于V5标签和翻译终止下游。每个克隆的唯一条形码序列都可以在文库库存文件中找到,易于在解卷积时识别。
  • 该文库有细菌甘油原液、质粒DNA和慢病毒颗粒形式。
  • ORF构建体可以作为质粒转染,或在难以转染的细胞中作为慢病毒颗粒转导。
  • ORF表达水平可以通过控制功能性病毒颗粒与细胞的比例来加以调节。
 
 
TRC3嘌呤霉素载体示意图及功能
 
 
图3. TRC3嘌呤霉素载体示意图及功能
 
 
载体标签 功能
5’ LTR 嵌合的5'长末端重复序列
Ψ Psi 病毒基因组包装信号
RRE Rev响应元件 — 增加全长病毒包装
SV40 猿猴病毒40(SV40)启动子
PAC 嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)基因赋予嘌呤霉素抗性
hEF1α RNA聚合酶 II 启动子人延长因子-1α
ORF 开放阅读框插件
v5 V5表位标签
Stop 三种终止密码子之一:TAA、TAG或TGA
WPRE 土拨鼠转录后调节元件:增强转基因的转录
3’ SIN LTR 3'自我灭活长末端重复序列
F1 ori 噬菌体衍生的ORI,允许ssDNA复制和包装到噬菌体颗粒中
Ampr 氨苄青霉素细菌选择标记
pUC ori 大肠杆菌中的高拷贝复制和维持

条形码(未显示) 汇集筛选应用条形码


 MISSION® TRC3的优点

  • 验证价值:筛选后进行RNAi 或CRISPR拯救实验以验证基因命中。
  • 持久的结果:基于慢病毒的系统产生ORF的组成型表达,从而产生长期稳定表达的富集细胞群。慢病毒载体非常适用于难以转染的细胞系或原代细胞系。
  • 充满信心的筛选:独有的TRC3嘌呤霉素ORF文库使用经济高效的汇集筛选功能,实现高通量、大规模筛选能力和数千种ORF的表达。
  • 节省时间:省却PCR、克隆和DNA序列验证步骤。

尽管cDNA合成通常在研究实验室中进行,但却耗时费钱。创建自己的克隆容易出错,并且可能需要执行多个步骤花几天时间才能完成,还需要进行序列验证(如下图4所示)。另外,还可能会引入突变,并且可能需要重做实验以获得期望的转录物。

我们完全测序的ORF克隆是蛋白质表达的理想捷径。预先克隆的MISSION® TRC3 ORF消除了从头克隆的不确定性,我们的在线订购工具使您能够搜索ORF克隆,并选择最适合您的目标基因的克隆产品。
 

传统的cDNA合成" 

图4. 传统的cDNA合成

 


 MISSION® TRC3 ORF的形式

MISSION® TRC3 ORF有细菌甘油原液、纯化DNA或病毒颗粒等形式。您可以从全基因组排列或汇集的文库、定制基因组集、或单个ORF克隆中进行选择。MISSION® TRC3系列可以根据各种研究需求进行定制。

细菌甘油原液形式:

  • 用TRC3 ORF质粒转化大肠杆菌细胞,以细胞原液形式提供,细胞保存在含有10%甘油冷冻保存剂的培养基中。
  • 细菌甘油原液是一种可再生资源 — 只需接种新鲜培养基并过夜培养,即可产生新鲜培养物。
  • 必须首先从新鲜细菌培养物中纯化出质粒,才能开始基因表达和验证实验。
  • 在用于哺乳动物细胞之前,必须通过Gateway克隆将含有目标ORF的TRC3入门质粒亚克隆到相容的载体中。
  • MISSION® TRC3入门系列和嘌呤霉素系列均可以细菌甘油原液形式提供。

质粒DNA形式

  • DNA以纯化的质粒形式提供,可随即用于亚克隆或表达。
  • 含有目标ORF的TRC3嘌呤霉素质粒可用于转染细胞,亦可包装到无复制能力的慢病毒中,以转导到所需的细胞培养物中或体内。
  • 在用于哺乳动物细胞之前,必须通过Gateway克隆将含有目标ORF的TRC3入门质粒亚克隆到相容的载体中。
  • MISSION® TRC3入门系列和嘌呤霉素系列均可以质粒DNA形式提供。

病毒颗粒形式:

  • 含有包装在慢病毒中的TRC3 ORF质粒,用于转导到所需的细胞系和体内。
  • 可提供高滴度和大容量选择(105 - 109粒/mL,0.1 mL - 10 mL)。
  105粒/mL 106粒/mL 107粒/mL 108粒/mL 109粒/mL
0.1mL    
0.2mL
1 mL
2 mL
5 mL  
10 mL  
  • MISSION® TRC3嘌呤霉素系列可以病毒颗粒形式提供。入门系列没有病毒颗粒形式,这是因为载体缺乏包装病毒颗粒所必需的病毒元件。

病毒转导后,ORF表达质粒DNA整合到宿主细胞的DNA中。细胞机器识别启动子并合成蛋白质。然后,所得基因产物和翻译的蛋白质可用于纯化、定位以表征蛋白质功能、或确定改变的表型是否是基因过表达的结果。

 

图5. 病毒转导后,ORF表达质粒DNA整合到宿主细胞的DNA中。细胞机器识别启动子并合成蛋白质。然后,所得基因产物和翻译的蛋白质可用于纯化、定位以表征蛋白质功能、或确定改变的表型是否是基因过表达的结果。

 


 ORF是如何分类的?

ORF克隆根据相应的NCBI Refseq转录的严格性进行分类。

完美匹配:ORF在核苷酸和蛋白质序列中100%匹配。  

近完美匹配:ORF至少99%蛋白质匹配(编码)或至少99%核苷酸匹配(非编码)。

较低匹配:ORF具有良好的“部分”匹配,但可能包含较大近邻插入缺失,表示存在截断或缺失/额外的外显子等。分数是使用蛋白质匹配(编码)或核苷酸匹配(非编码)计算而得。


 基因拯救 / 验证

RNAi 拯救

RNA干扰通过进行功能丧失基因研究来评估介导细胞表型的人基因的功能。除了通过与靶转录物的完全互补性,进行基因特异性沉默之外,RNAi还可以通过接种区域互补性调节非预期的转录物来引起表型变化,这可能导致靶基因功能的错误解释。

有必要通过RNAi拯救实验验证siRNA或shRNA介导的表型的靶特异性。表型拯救的常用方法涉及使用对siRNA或shRNA靶向具有抗性的外源表达的转录物。

这些转录物来自TRC3人ORF系列。TRC3 ORF缺乏3'UTR和5'UTR,使得ORF对靶向基因转录物3'UTR的siRNA或shRNA具有抗性。siRNA / shRNA仅沉默含有3'或5'UTR的基因靶标的内源表达。如果siRNA / shRNA靶标位于ORF的编码序列内,则可以使用市售试剂盒容易地完成定点诱变,以将沉默突变引入结合区,使突变的ORF对抑制具有抗性。

如果目标基因的ORF的外源表达导致表型拯救,则证实表型是由于shRNA / siRNA的靶标特异性作用造成的。如果未观察到表型拯救,则表明shRNA / siRNA效应可能是非特异性的或脱靶的。

shRNA产品

siRNA产品

CRISPR拯救

CRISPR / Cas9(成簇规律间隔短回文重复序列 / CRISPR相关蛋白质9)是选择性敲除基因表达的有效方法。它是一种涉及Cas9蛋白质和向导RNA(gRNA)的核糖核蛋白(RNP)复合物。gRNA靶向感兴趣的基因组序列,并指导Cas9核酸酶在DNA中产生双链断裂。基因敲除是由断裂位点的插入或删除引起的移码突变的结果,其通过非同源末端连接(NHEJ)在DNA修复过程中自然发生。基因敲除是永久性和遗传性的(Marraffini & Sontheimer, 2010)。

与RNAi 研究一样,重要的是拯救CRISPR / Cas9敲除实验,以确保观察到的表型对预期靶标具有特异性。有许多生物信息学平台可用于检查CRISPR / Cas9向导RNA的脱靶效应,但金牌标准实验始终是引入CRISPR / Cas9抗性ORF,并重新评估表型。如果外源ORF恢复野生型功能,则该效应可归因于该基因。如果表型没有逆转,那么向导的脱靶效应可能是原因。与上述技术类似,外源ORF可在PAM位点突变,以使其对CRISPR / Cas9切割具有抗性。此外,已经显示,靶向编码外显子的3'末端并延伸到5'内含子中的向导RNA将不靶向外源ORF,因为ORF不含内含子。如果您的CRISPR / Cas9策略允许,可以在不修饰ORF的情况下使用该技术。

来自(Incontro, 2014):

“[......必须进行拯救实验,明确排除所观察到的表型是因为脱靶造成的。对于拯救实验,重要的是确保拯救构建体本身不会被CRISPR靶向...... 我们搜索了包含内含子-外显子连接的特定gRNA序列,使得切割位点(位置3)在外显子中,但大多数gRNA序列位于内含子内。通过使用这种非常简单的策略,现在能够使用未修饰的cDNA进行拯救实验,这极大地简化和加速了表型的验证。“


 基因过表达研究

虽然RNAi 和CRISPR技术允许科学家在遗传上改变或沉默靶基因,但ORF是有价值的工具,不仅仅限于确认基因敲减/敲除的命中。ORF可以独立于CRISPR或RNAi 系统使用,以“打开”或“过表达”特定基因。一次一个地翻转基因上的开关可以帮助揭示单个基因的功能,例如那些在癌症中发挥作用的基因。ORF已被用于一些研究,其中基因筛选、表达分析和遗传拯救是重要方面。基因和蛋白质的过度表达广泛用于功能基因组学、蛋白质组学和系统生物学研究。

基因过表达研究的一些应用

 

图6. 基因过表达研究的一些应用。改编自:Gene Overexpression: Uses, Mechanisms, and Interpretation (Prelich, 2012)

部分研究包括:

  1. COT drives resistance to RAF inhibition through MAP kinase pathway reactivation
  2. KRAS and YAP1 converge to regulate EMT and tumor survival

 

联系我们

如有问题或想咨询,请发送电子邮件至:MISSIONRNAI@sial.com

MISSION是Sigma-Aldrich Co. LLC.标签许可的注册商标。

 


 材料

     


 参考文献

  • Eisenstadt, L. (2010, November 30). What is an ORF? Retrieved from https://www.broadinstitute.org/blog/what-orf.
  • Incontro S, e. a. (2014). Efficient, complete deletion of synaptic proteins using CRISPR. Neuron, 1051-7.
  • Marraffini, L., & Sontheimer, E. (2010). Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity. Nature, 568-71.
  • Prelich, G. (2012). Gene Overexpression: Uses, Mechanisms, and Interpretation. Genetics, 190(3), 841-854. doi:10.1534/genetics.111.136911.
  • Yang X, Boehm JS, Yang X, et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature methods. 2011;8(8):659-661. doi:10.1038/nmeth.1638.