核酸电泳方法 & 简介

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 简介——什么是电泳?

电泳是根据基质上的净电荷、大小和构象对核酸(DNA 和 RNA)和蛋白质等大分子进行分离纯化的方法。由于磷酸基团的存在,核酸具有整体负电荷。因此,它们向阳极移动的速度完全取决于它们的大小。蛋白质含有整体的正电荷或负电荷;这使得蛋白质分子能够向一个称为等电点的 pH 移动,在该等电点分子没有净电荷。通过对蛋白质进行变性,并给予它们均匀的电荷,就可以根据大小将它们分开。大分子在由琼脂糖或聚丙烯酰胺组成的基质或凝胶内电泳。由这些聚合物制成的凝胶含有孔隙,当施加电压时,蛋白质和核酸可以通过这些孔隙。


 DNA 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从海藻中提取的多糖,通常以0.5-2%的浓度用于DNA和RNA电泳。它可形成具有合适孔径的晶格,以便核酸能够移动到正极。 核酸的琼脂糖凝胶电泳

图1: 核酸的琼脂糖凝胶电泳


 方法:DNA 琼脂糖凝胶电泳

所需材料和试剂


 预制琼脂糖凝胶

Sigma-Aldrich 可提供加入溴化乙锭的8孔、20孔和24孔预制琼脂糖凝胶。如果使用预制凝胶,则继续“凝胶通电”步骤。
 

产品编号 琼脂糖含量 孔样式 适用于 定位
P5472 1.0%   8 孔 DNA 纵向
P5722 1.0% 20 孔 DNA 横向
P5972 1.0% 24 孔 DNA 纵向
P6097 4.0% 24 孔 DNA 纵向

或者,使用以下步骤铸造自己的琼脂糖凝胶。


 琼脂糖溶液的制备

  • 量取适量琼脂糖粉,加到烧杯或烧瓶中的 1X TAE 缓冲液中。
    注意:琼脂糖量取决于所需凝胶的百分比。琼脂糖溶液的体积必须根据所用凝胶拖盘的大小来制备
  • 在磁性热板上加热溶解琼脂糖。或者,可以在微波炉中加热,每分钟旋转一次,直到琼脂糖完全溶解。
  • 当琼脂糖冷却至 50-60°C 时,向溶液中加入溴化乙锭(0.5µg/mL 最终浓度)。另一种方法是电泳后将凝胶浸入溴化乙锭溶液中。
    重要提示: 溴化乙锭是一种致癌剂。处理溴化乙锭时务必戴手套和口罩。
  • 琼脂糖冷却时,准备好凝胶托盘以进行凝胶浇铸,使琼脂糖溶液在凝固前不会流出。这可以通过使用托盘隔障、弯曲机或用传统的实验室胶带密封来实现。将梳子置于凹槽中,并将托盘置于平坦的水平位置。
  • 慢慢倒入琼脂糖溶液,使其均匀地分布在托盘上,确保没有气泡滞留在凝胶中。使凝胶在室温下固化。
  • 取出梳子,用托盘将凝胶转移到主罐,加入1X电泳缓冲液,直到凝胶刚好被缓冲液覆盖


 DNA 样品的制备

Sigma-Aldrich 提供 GenElute™ 试剂盒,用于从植物和真菌 (  E5038 )、哺乳动物细胞或组织 (G1N70G1N10 and g1N35) 、以及血液(NA2010 和 NA2020)中分离 DNA。

为保护分离的 DNA 不被降解,建议将 DNA 溶解在 TE 缓冲液中 (  T9285 )。

此外,DNAstable® 试剂盒 (93000-001-1EA93021-001-1EA53091-016-2ML 和 93121-017-1EA)可用于DNA运输或确保DNA在室温下的储存和稳定

  • 按标准方法从细胞或组织中分离 DNA。
  • 用溴化乙锭染色时在琼脂糖凝胶上检测所需的最低 DNA 浓度为 2 ng。
  • 将核酸样品与 10X 上样缓冲液混合。一般情况下,3 μL 上样缓冲液就足够了,但少于 10 μL 的样品可使用更少的量。


 凝胶通电

  • 使用移液器将样品小心地加入孔中。也可加入含有各种大小核酸片段的适当标记物(D7058D3937D3812)。
  • 将主罐盖上盖子并连接电源。在琼脂糖凝胶中给样品施加的典型电压为 90-150v。
  • 应使用橙色 G ( O3756 )、溴酚蓝 (  B8026 ) 或二甲苯靛蓝 (  x4126 ) 追踪染料前沿。

二甲苯腈蓝(bp)溴酚蓝(bp)
 

凝胶浓度 (%w/v) 有效分离范围(bp) 二甲苯腈蓝(bp) 溴酚蓝(bp)
3.5 1000-2000 460 100
5.0 50-500 260 65
8.0 60-400 160 45
12.0 40-200 70 20
15.0 25-150 60 15
20.0 6-100 45 12


 凝胶染色和观察

>凝胶染色和观察

  • 电泳后,将凝胶转移至紫外透射仪,并获取凝胶图像。
  • 样品将显示为亮带。

未加入溴化乙锭的凝胶:

  • 将电泳后的凝胶转移至SYBR® 绿色核酸染色剂(1:10,000 稀释,避光染色)或 0.5µg/ml 溴化乙锭染色溶液中 15-30 分钟。
  • 如果使用 SYBR® 绿色核酸染色剂,则可在染色后立即获取凝胶图像。
  • 如果使用溴化乙锭,将凝胶置于蒸馏水中 10-30 分钟,确保凝胶完全浸入水中。
  • 将凝胶转移至紫外透射仪并获取凝胶图像。
  • 样品将显示为亮带。


 琼脂糖凝胶的荧光染色

Sigma-Aldrich 可提供 Nancy-520 (01494),这是一种可用于替代溴化乙锭的荧光染色剂。它是一种更安全、更稳定、更环保的溴化乙锭替代品。Nancy-520 的激发波长为 520 nm,发射波长为 560 nm。

加入Nancy-520 的凝胶:

  • 浇铸凝胶时可将 Nancy-520 加入琼脂糖中(10 μL 至 50 mL 琼脂糖)。
  • 通电后,获取凝胶的荧光图像。

未加入 Nancy-520 的凝胶:       

  • 加入 10 μL Nancy-520 至 50 mL 1X TBE 缓冲液制备染色液。
  • 电泳结束后,将凝胶浸入染色液中,并在摇床上避光保存 1小时。
  • 用 1X TBE 缓冲液冲洗凝胶 10-30 秒。
  • 拍摄凝胶的荧光图像。

 Sigma-Aldrich 水平电泳系统

图 2: Sigma-Aldrich 水平电泳系统

 


  RNA 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳可以根据RNA的大小和完整性来评估RNA的质量。然而,由于广泛的分子内碱基配对干扰了琼脂糖凝胶上基于大小的迁移,RNA形成了各种二级结构。因此,RNA 分子必须使用甲酰胺和甲醛进行变性。


 方法:RNA 琼脂糖凝胶电泳


 所需材料和试剂

确保所有使用的设备都不含RNA酶,所有使用的缓冲液都是在无 RNA酶的水中制成的。


 预制琼脂糖凝胶

Sigma-Aldrich可提供 8 孔 RNA预制1.25% 琼脂糖凝胶 (P6222)。这种预制凝胶不含溴化乙锭。如果使用预制凝胶,则继续“凝胶通电”步骤。

或者,使用以下步骤铸造自己的琼脂糖凝胶


 琼脂糖溶液的制备

  • 量取适量琼脂糖粉,加到烧杯或烧瓶中的 1X MESA 缓冲液中。
    注意:琼脂糖量取决于所需凝胶的百分比。琼脂糖溶液的体积必须根据所用凝胶拖盘的大小来制备。
  • 在磁性热板上加热溶解琼脂糖。或者,可以在微波炉中加热,每分钟旋转一次,直到琼脂糖完全溶解。
  • 当琼脂糖冷却至 50-60°C 时,向溶液中加入溴化乙锭(0.5µg/mL 最终浓度)。另一种方法是电泳后将凝胶浸入溴化乙锭溶液中。

    重要提示: 溴化乙锭是一种致癌剂。处理溴化乙锭时务必戴手套和口罩。
  • 琼脂糖冷却时,准备好凝胶托盘以进行凝胶浇铸,使琼脂糖溶液在凝固前不会流出。这可以通过使用托盘隔障、弯曲机或用传统的实验室胶带密封来实现。将梳子置于凹槽中,并将托盘置于平坦的水平位置。
  • 慢慢倒入琼脂糖溶液,使其均匀地分布在托盘上,确保没有气泡滞留在凝胶中。使凝胶在室温下固化。
  • 取出梳子,用托盘将凝胶转移到主罐,加入1X电泳缓冲液,直到凝胶刚好被缓冲液覆盖。


 RNA 样品的制备

  • 哺乳动物细胞或组织(RTN70RTN10 和 RTN350)可使用    TRI Reagent®   (  T9424 ) 或 GenElute™ 试剂盒从细胞或组织样品中分离 RNA
  • 为了确定 RNA 的质量和浓度,分别在 260 nm 和 280 nm 处读取样品的吸光度。吸光度比值A260/A280  为 1.8-2.1 表示 RNA的质量较好。为了通过琼脂糖电泳法进行有效检测,至少需要 5 μg 的 RNA。
  • 将 1 倍体积的 RNA 样品与 2-5 倍体积的样品缓冲液混合。
  • 将样品加热至 65°C 10 分钟,并立即在冰上冷却,以防止 RNA 分子复性。


 凝胶通电

  • 使用移液器将样品小心地加入孔中。如果需要,也可加入含有各种大小 RNA 片段 (  R7020  ,    R7644 ) 的适当标记物。
  • 将主罐盖上盖子并连接电源。在琼脂糖凝胶中给样品施加的典型电压为 90-150v。
  • 应使用 Pyronin Y (  P9172 )、溴酚蓝 (  B8026 ) 或二甲苯靛蓝 (  x4126 ) 跟踪染料前沿。
凝胶浓度 (%w/v) 有效分离范围(bp) 二甲苯腈蓝(bp) 溴酚蓝(bp)
3.5 1000-2000 460 100
5.0 50-500 260 65
8.0 60-400 160 45
12.0 40-200 70 20
15.0 25-150 60 15
20.0 6-100 45 12


 凝胶染色和观察

加入溴化乙锭的凝胶:

  • 电泳后,将凝胶转移至紫外透射仪,并获取凝胶图像。
  • 样品将显示为亮带。
未加入溴化乙锭的凝胶:
  • 在无RNA酶的蒸馏水中轻轻洗涤凝胶 10 分钟 以除去甲醛。
  • 电泳后将凝胶转移至SYBR® 绿色核酸染色剂 (1:10,000) 或 0.5µg/ml 溴化乙锭染色溶液中 15-30 分钟。
  • 如果使用 SYBR® 绿色核酸染色剂,则可在染色后立即获取凝胶图像。
  • 如果使用溴化乙锭,将凝胶置于蒸馏水中 10-30 分钟,确保凝胶完全浸入水中。
  • 将凝胶转移至紫外透射仪并获取凝胶图像。
  • 样品将显示为亮带。
 


 DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和双丙烯酰胺(N,N'-亚甲基双丙烯酰胺)反应形成高度交联的凝胶基质。丙烯酰胺凝胶可以分离长度相差仅 0.2% 的 DNA 片段。虽然蛋白质在聚丙烯酰胺上分离前必须经过SDS变性,但带负电荷的DNA分子不需要变性。与琼脂糖凝胶相比,聚丙烯酰胺凝胶可以容纳更大量的样品,并提供高分辨率的 DNA 片段。

尽管DNA的预制PAGE凝胶被广泛使用,但如果PAGE是实验室的常规程序,那么成本就很高。熟练的技术人员可以以预制凝胶的仅一小部分成本轻松制备 PAGE 凝胶。内部制备的 PAGE 凝胶可提供更好的分辨率,并有助于获得一致的结果。

 


 方法:DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳

所需材料和试剂

垂直电泳室有电源、玻璃板、垫片和梳子

  • 30% 聚丙烯酰胺溶液(0.45 mM 滤膜过滤,4℃ 避光保存):
         29 g 丙烯酰胺
         1g 双丙烯酰胺
         100 mL 双蒸水
  • 10% 过硫酸铵溶液
  • 四甲基乙二胺
  • 电泳缓冲液:
        1X TBE 于蒸馏水中配制:
        89 mM Tris (pH 7.6)
        89 mM 硼酸
         2 mM EDTA
  • 5X 凝胶上样缓冲液:
      80% 甘油 75%
           溴酚蓝    (  B5525 ) 0.25%
           二甲苯腈蓝    (  X4126 ) 0.25%
         1M Tris (pH 7.4) 10 mM
         5 MNaCl 10 mM
         0.5 MEDTA 10 mM
        10%SDS 0.1%
  • 溴化乙锭 0.5µg/ml
  • 透照器
    重要提示: 丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有神经毒性。所有步骤都应戴无粉手套进行。


 程序

  • 用去离子水和乙醇清洁凝胶浇铸装置中的玻璃板和垫片。
  • 将玻璃板与垫片组装在平稳的表面上。
  • 根据所需凝胶的百分比,使用以下体积配制凝胶溶液 (12 mL) 。
凝胶 % 30% 丙烯酰胺 (mL) 10X TBE (mL) 10%APS (µL) 水 (mL) 四甲基乙二胺(TEMED)* (μL)
8% 3.2 1.2 200 7.6 10
10% 4.0 1.2 200 6.8 10
12% 4.8 1.2 200 6.0 10

*TEMED 必须是最后添加的成分。

  • 将凝胶溶液倒入装有垫片的培养板中。立即插入梳子,确保没有气泡滞留在凝胶中或靠近孔口。将凝胶在室温下放置约 30-60 分钟。

    聚合凝胶可用保鲜膜包裹并储存在 4°C 条件下,以备将来使用。
  • 当准备进行电泳时,将凝胶板安装在仪器上,用1X TBE缓冲液填充电泳室。建议在5v /cm下预运行约10分钟。
  •  通过将 1 μL 样品与 5μl 5x 凝胶上样缓冲液混合来制备寡核苷酸样品。小心地将样品加入孔中,不得产生任何气泡。
  • 大型凝胶可以约70 V通电14-16 小时或 125-150 V通电2-4 小时,或直到染料前沿接近凝胶底部。确保凝胶不会过热。或者,样品可以在冷室中施加更高电压。
  • 用刮刀撬开玻璃板,把上面的玻璃板分开。用 0.5μG/mL 溴化乙锭溶液给凝胶染色,同时仍然将其附着在下玻璃板上 5-10 分钟。
  • 将玻璃板上的凝胶浸泡在蒸馏水中 10-30 分钟 以去除多余的染色并降低背景染色。
  • 用保鲜膜包裹凝胶和凝胶板,倒转置于紫外透射仪上并获取凝胶图像。
  • 样品将显示为亮带。
  • 所需条带可用精细的手术刀切割并适当处理,以便回收 DNA。
如果在寡核苷酸中加入 35S 或 33P核苷酸,请遵循以下步骤:
  • 将凝胶在 10% 乙酸中浸泡 15 分钟。
  • 将凝胶拍干,用保鲜膜包裹。
  • 在 80°C 真空干燥器中干燥凝胶 20 分钟或更长时间。
  • 去除保鲜膜,在暗室将凝胶暴露于 X 光胶片中。
 Sigma-Aldrich 垂直电泳系统
图 3: Sigma-Aldrich 垂直电泳系统
 


  参考资料

  • Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press, 1989.