寡核苷酸解链温度

寡核苷酸的解链温度(Tm)是指50%寡核苷酸与其完美互补链构成双链体,而另外50%游离于溶液中的温度。Tm对于分子生物学中的许多技术都极为重要,例如 PCR、南方印迹、原位杂交等。这些传统技术中的一些仍然广泛地与更新的技术结合使用,例如用于下一代测序中的基于PCR的样品文库制备。

确定Tm的最常用实验方法是测量寡核苷酸及其互补链作为温度函数的吸光度变化(图1)。虽然实验确定的Tm值是最准确的,但在常规应用中使用传统分子技术时,这些值不是必需的。

寡核苷酸Tm的实验测定示例用UV-Vis分光光度计在恒温槽中进行测量

图1. 寡核苷酸Tm的实验测定示例用UV-Vis分光光度计在恒温槽中进行测量。Tm是双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)曲线上平台之间中间的读数。

已经考虑了可能使用的技术以及影响解链的因素(序列浓度、序列长度、碱基组成、离子强度等)的理论方法,可用于计算预期的Tm

 

 理论Tm方法

根据序列的性质,我们使用两种方法之一来计算Tm

  • 最邻近法
  • 基本方法

最邻近法

我们用来计算Tm的主要方法是最邻近法1,2,我们将这种方法用于序列长度为15至120个碱基的寡核苷酸(我们的标准DNA寡核苷酸产品的长度上限)。该方法被认为是最准确的,因为它考虑了寡核苷酸的序列而不是像其他方法那样仅仅考虑了基本组成。最邻近法考虑了热力学以及影响Tm的其他因素,包括寡核苷酸和单价阳离子浓度。

我们使用以下修正的最邻近法公式:

式中:

Tm
= 解链温度,单位为℃

ΔH = 焓变,单位为kcal mol-1(退火/解链过程中的能量变化) 

A = 常数,为-0.0108 kcal K-1ᐧmol-1(退火/解链过程中的螺旋起始)

ΔS = 熵变,单位为kcal K-1ᐧmol-1 (无法工作(即无序)的能量) 

R = 气体常数,为0.00199 kcal K-1ᐧmol-1(针对温度按比例调节能量的常数)

C = 寡核苷酸浓度,单位为M或mol L-1 (我们使用0.0000005,即0.5 μM)

-273.15 = 转换因子,用于将预期的K氏温度转换为°C

[Na+] = 钠离子浓度,单位为M或mol L-1 (我们使用0.05,即50 mM)

对于ΔH、ΔS和A,存在有限数量的最邻近值,其可以直接插入上述公式中(表1)。

表1. ΔHΔS的最邻近值。在作为基本最邻近公式(参考文献1)来源的论文中,ΔSAR以cal K-1ᐧmol-1为单位,因此公式用因子1,000乘以ΔH(以kcal mol-1为单位)来平衡单位。我们的生产系统和序列计算器OligoEvaluator™中的算法使用了这种逻辑。然而,这里我们以kcal K-1ᐧmol-1作为ΔSA和R的单位,因此每个参数的单位匹配,使得下面的计算示例在量纲分析中更直观。
无论采用哪种方法,计算的Tm都是相同的。
 

分子 DNA RNA
相互作用 ΔH ΔS ΔH ΔS
AA/TT* -9.1** -0.0240 -6.6 -0.0184
AT/TA -8.6 -0.0239 -5.7 -0.0155
TA/AT -6.0 -0.0169 -8.1 -0.0226
CA/GT -5.8 -0.0129 -10.5 -0.0278
GT/CA -6.5 -0.0173 -10.2 -0.0262
CT/GA -7.8 -0.0208 -7.6 -0.0192
GA/CT -5.6 -0.0135 -13.3 -0.0355
CG/GC -11.9 -0.0278 -8.0 -0.0194
GC/CG -11.1 -0.0267 -14.2 -0.0349
GG/CC -11.0 -0.0266 -12.2 -0.0297

*左序列是5'至3',而右序列是3'至5',例如对于AA/TT,AA为5'至3',TT为3'至5'。选择值时,始终在5'至3'的方向选择,无论正确方向中是左还是右序列。

** 负值表明退火是焓和熵有利的。正值反映逆反应(解链),Tm计算相同。 

最邻近法计算示例。此示例将演示如何手动计算下列序列的Tm

                                        5'-AAAAACCCCCGGGGGTTTTT-3'

这是上述序列的反向互补链:

                                        5'-AAAAACCCCCGGGGGTTTTT-3'

                                        3'-TTTTTGGGGGCCCCCAAAAA-5'

第一步:找出ΔH和ΔS的最邻近值,并对每个参数求和。

读取靶序列5'至3',所有最邻近点的ΔH和ΔS值可以在表1中找到。所找到的最邻近点对及其ΔH和ΔS值(及总和)如下:

最邻近点 ΔH ΔS
AA/TT -9.1 -0.0240
AA/TT -9.1 -0.0240
AA/TT -9.1 -0.0240
AA/TT -9.1 -0.0240
GT/CA -6.5 -0.0173
GG/CC -11.0 -0.0266
GG/CC -11.0 -0.0266
GG/CC -11.0 -0.0266
GG/CC -11.0 -0.0266
CG/GC -11.9 -0.0278
GG/CC -11.0 -0.0266
GG/CC -11.0 -0.0266
GG/CC -11.0 -0.0266
GG/CC -11.0 -0.0266
GT/CA -6.5 -0.0173
AA/TT -9.1 -0.0240
AA/TT -9.1 -0.0240
AA/TT -9.1 -0.0240
AA/TT -9.1 -0.0240
总和 -185.7 -0.4672

 

第二步:将值插入最邻近法公式中以计算解链温度

 

作为比较,这是由我们的在线寡核苷酸序列计算器OligoEvaluator™确定的值:
 

 

手动计算的69.6与OligoEvaluator™的计算值69.7非常吻和(差异是因为在这个计算示例中,原始文献中气体常数1.987四舍五入为1.99)。

除了OligoEvaluator™之外,69.7也是这种寡核苷酸所附的技术数据表中给出的值。

基本方法

我们用来计算Tm的第二种方法是基本方法(修正的Marmur Doty公式3),我们将其用于具有短序列长度的寡核苷酸,即14个碱基或更少的寡核苷酸。该方法部分来自于膜杂交实验,它假定引物浓度为50 nM,单价离子(Na+)浓度为50 mM,pH为7.0。尽管膜杂交实验现在不像几十年前最初进行该研究时那样经常进行,但PCR等更现代的技术还在使用这种计算方法,在计算中使用了一个校正因子来修正可能游离于溶液中的寡核苷酸。

我们使用以下修正过的Marmur Doty公式计算:

式中:


Tm
= 解链温度,单位为℃

A
= 序列中腺苷核苷酸的数量

T
= 序列中胸苷核苷酸的数量

C
= 序列中胞苷核苷酸的数量

G
= 序列中鸟苷核苷酸的数量

-7 = 溶液的校正因子

Marmur Doty计算示例。此示例将演示如何手动计算下列序列的Tm

                                                            5'-ACGTCCGGACTT-3'

第一步:将值插入Marmur Doty公式中以计算解链温度。

作为比较,这是由我们的在线寡核苷酸序列计算器OligoEvaluator™确定的值:

手动计算的31.0与OligoEvaluator™计算值31.0完全吻合。

除了OligoEvaluator™之外,31.0也是这种寡核苷酸所附的技术数据表中给出的值。

如果您打算使用这种短寡核苷酸进行膜杂交实验,我们建议您手动加+7到显示的Tm,即上述值为38°C。


 总结

使用了两种方法中的一种确定寡核苷酸的Tm,并且针对传统分子技术对其进行了优化。如果需要其他帮助,请咨询我们的技术服务组:oligotechserv@sial.com


 材料

     

 参考文献

  1. Freier SM, Kierzek R, Jaeger JA, Sugimoto N, Caruthers MH, Neilson T, & Turner DH (1986). Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability. Proc Natl Acad Sci, 83, 9373-9377.
  2. Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, & Marky LA (1986). Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci, 83, 3746-3750.
  3. Marmur J & Doty P (1962). Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature. J Mol Biol, 5, 109-118.