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简介及历史大事记


 引言

聚合酶链反应(PCR)用于生物科学研究的所有领域,包括临床、法医和诊断领域。PCR技术的广泛采用彻底改变了生命科学研究。

基础技术已经有了许多改进,并发展出许多变型,以适应具体应用,包括逆转录PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qPCR)、逆转录qPCR(RT-qPCR)和数字PCR(dPCR)。本指南的适合读者为具有分子生物学背景的科学家,以及有兴趣详细了解PCR技术的其他领域的科学家。本文将给出技术的基本原理以及实用例子和理论概念。

为了说明理论概念,本文将给出可用于分析样品质量、优化测定条件、确定测定效率和RT线性的实验方案。这些实验方案可以很容易地改编以适用于其他所有研究应用。


 历史大事记

1971年,Kjell Kleppe和诺贝尔奖得主Gobind Khorana发表了一项技术,该技术代表了核酸复制方法的基本原理:

“...... DNA双链体会变性形成单链。该变性步骤在存在足够过量的两种适当引物的条件下进行。冷却后,可获得两种结构,每种结构含有与引物适当复合的全长模板链。添加DNA聚合酶即结束修复复制过程。应该产生两个原始双链分子。每当添加新鲜的酶时,整个循环即会重复进行。然而,DNA双链体变性后冷却时,有可能会复性变回原始双链体,该复性反应可能会比模板-引物复合物的形成更占上风。如果通过调节引物的浓度不能避免这种趋势,显然必须分离链,然后进行修复复制。在每个修复复制循环后,必须重复链分离过程。“1

虽然这段文字看起来清晰描述了现在被称为PCR的过程,但当时无法通过实验验证,因为引物设计所需的靶序列不易获得,也没有方便的方法来制造合成的PCR引物寡核苷酸。

最初,当考虑DNA扩增过程时,Kary Mullis等人2假设当引物被添加到变性的DNA中时,它们会被延伸,延伸产物将从其模板中展开,再次引发,然后再重复进行延伸过程。然而,实际情况并非如此,并且在每轮合成后,必须将DNA几乎加热至沸腾,以使新形成的双链DNA变性。然后用于合成的DNA聚合酶 I 的Klenow片段在高温下失活,因此在每个循环开始时需要更多的酶,正如Kleppe所预测的1。导致普遍采用PCR技术的一个关键发展是使用热稳定DNA聚合酶的概念,该酶能够耐受反复变性的高温。DNA聚合酶 I 的Klenow片段后来被耐热Taq DNA聚合酶取代3,4。当使用Taq DNA聚合酶时,可以在封闭的反应管中进行几轮扩增而不需补充酶。此外,还可以扩增更大的片段,使用较高温度的反应足以提高复制保真度,减少非特异性产物形成,并允许直接在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上检测产物5,6,7

1993年,诺贝尔化学奖由Michael Smith与Kary Mullis共得,前者”在建立基于寡核苷酸的定点突变以及蛋白质研究的发展中做出了基础性贡献“,后者”发明了聚合酶链反应( PCR)方法“。

在授予1993年诺贝尔PCR奖的大约相同时间,Higuchi等人8发现,可以通过添加与累积的PCR产物结合的荧光标记来监测PCR过程。随着PCR产物浓度的增加,荧光信号的强度也增加。这一发现为现代定量实时PCR(qPCR)铺平了道路。在目前的qPCR技术中,这些荧光信号是通过包含荧光DNA结合染料或寡核苷酸探针产生的。荧光DNA结合染料,例如SYBR® Green I,包含在PCR缓冲液中。当染料在溶液中游离时,它会以振动能的形式释放出过剩的能量。然而,随着DNA靶标的扩增,这些染料与DNA产物结合,并采取另一种构象。这种构象变化降低了分子的活动能力,并导致过剩的能量以荧光形式发射出来。因此,DNA结合的染料比未结合的染料具有更高的荧光。监测反应的另一种方法是在反应物中包括标记的引物9,或者为了增加特异性,在两个引物之间插入一个额外的寡核苷酸探针。该寡核苷酸探针被标记,并且在大多数情况下,还被淬灭。有多种探针可供选用,但最常用的是双标记探针(也称为TaqMan®)10、Molecular Beacons11、Scorpions® 探针12、和LightCycler® 探针13(参见定量PCR和数字PCR检测方法)。

最近的qPCR发展是数字PCR(dPCR),在这种技术中,样品被稀释,并被分成数百至数百万个反应舱。稀释和划分必须使得每个舱含有零个或一个模板拷贝,并且起始浓度根据具有正信号的分区与具有负信号的分区的比例来估计。该技术使用泊松分布来量化靶拷贝。由于靶标被稀释成单个拷贝,因此dPCR特别适用于需要在高浓度野生型序列中定量稀有突变的应用(参见数字PCR)。

除了基因组DNA序列分析之外,长期以来还一直认为用PCR研究特定mRNA序列可以产生关于细胞生物学的基本信息。研究正常组织与患病组织之间的基因数量变化,或寻找响应药物治疗的基因表达的变化,都被用于了解对基因表达的调节如何成为复杂细胞控制系统的组成部分。测量mRNA需要额外的逆转录(RT)步骤,以将RNA转化为适合PCR扩增的DNA模板。这使用逆转录酶和来自一种或多种寡核苷酸引物的延伸来进行。逆转录反应的引发可以来自序列特异性引物,来自沿mRNA长度杂交的一系列随机引物,或者来自直接连接于大多数信使RNA序列的3' 末端(聚A拖尾)的腺苷道的引物。在从引物延伸后,产生称为第一链cDNA的RNA与DNA的双链杂交体。然后,该cDNA成为用于PCR的合适模板,并且通过半定量或优选定量PCR确定特定RNA模板的相对数量(参见逆转录)。

最近,已经发现了一系列小的非编码RNA(ncRNA)物种,包括微RNA(miRNA)。越来越明显的是,miRNA分子的表达谱可以用作特定疾病特征遗传生物标志物。使用PCR扩增这些靶标是特别具有挑战性的,因为它们非常小,并且没有天然聚A拖尾。然而,有一些方法可以用来分析这些分子的遗传信息,例如通过添加人工聚A拖尾来捕获样品中的所有miRNA,然后对目标靶进行选择性qPCR(参见PCR / qPCR / dPCR测定设计)。

无论选择什么样的PCR技术或应用,理论上,在每个PCR循环中,应复制单个模板分子。假设在每个循环中都是绝对、完美的复制,这将在40轮扩增后产生240或1012个相同的分子(扩增子)。然而,任何基于PCR的测定的实际灵敏度都由以下因素决定14:测定的设计(如PCR / qPCR / dPCR测定设计所述)、样品质量和测定对抑制剂的敏感性(如样品纯化和质量评估所述)、以及优化(如测定的优化和验证所述)。有效的测定需要在应用之前考虑所有这些因素。

除了动态范围外,基于PCR的测定的分析灵敏度取决于数据的差异性。样品基质中抑制剂的存在,反应物中脱靶产物的降解和非特异性扩增,都是差异性的潜在来源。如果这些在生物样品中随机或伪随机地发生,则反复测量可以将差异性对最终结果的影响降至最低。然而,有时差异性可能不是随机的,而是系统性的。在这些情况下,重复反应的平均值不会缓解问题。对于系统性和随机性技术误差,最好进行实验,以最大限度地减少误差。

此外,为了防止由于反应差异性引起的不确定性,在任何实验中,所有样品都应包括一系列对照,这很重要。对照的选择以及是否需要包含对照,应始终仅取决于研究的性质。科学诚信应该是所有实验设计背后的驱动因素。如果不进行充分的实验而甚至导致项目被撤销,就意味着对资源的浪费15,16。有些对照当然应该被认为是强制性的,而且应该提供原始数据以供检查,特别是当研究或分析的结果可能导致关乎生死的决定时17。与实验样品并行运行的对照,被广泛用作检验测定质量的手段,而且也广泛应用于故障排除过程中,如故障排除所述。近年来,人们已经认识到报告测定质量的重要性。由国际知名的分子生物学专家组成的团队编制了MIQE指南:发表实时定量PCR实验结果的最基本信息指南17。这些指南指导研究人员完成测定质量控制的整个过程。研究人员需要在测定检验过程中收集来自对照组的信息,以确保其实验符合MIQE要求。为了跟进对该出版物的反应,对qPCR出版物进行了审查,结果显示已有越来越多的人采纳这些指南18。最近出版了一些类似的建议,针对包含dPCR实验数据的研究19


 材料

     


 参考文献

  1. Kleppe, K., et al., Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases. J. Mol. Biol. 56: 341-361 (1971).
  2. Mullis, K.B. 1997. The Polymerase Chain Reaction (Nobel Prize Acceptance Speech). World Scientific Publishing Co, Singapore.
  3. Saiki, R.K., et al., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491 (1988).
  4. Lawyer, F.C., et al., High-level expression, purificationand enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5’ to 3’ exonuclease activity.PCR Methods Appl. 2: 275-287 (1993).
  5. Saiki, R. K., Scharf,S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354 (1985).
  6. Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. and Erlich, H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 Pt 1:263-273 (1986).
  7. Mullis, K.B. and Faloona, F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155: 335-350 (1987).
  8. Higuchi, R., et al., Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA
    amplification reactions. Biotechnology (N. Y. ) 11: 1026-1030 (1993).
  9. Liu, X.K.and Hong, Y. Q-priming PCR: a quantitative real-time PCR system using a self-quenched BODIPY FL-labeled primer. Anal. Biochem. 360: 154-156 (2007).
  10. Holland, P.M., et al., Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’----3’ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88: 7276-7280 (1991).
  11. Tyagi, S. and Kramer, F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 14: 303-308 (1996).
  12. Whitcombe, D., et al., Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat. Biotechnol. 17: 804-807 (1999).
  13. Wittwer, C.T., et al., Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques 22: 130-138 (1997).
  14. Nolan, T., et al., Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat.Protoc. 1:1559-1582 (2006).
  15. Fang, F.C. and Casadevall, A. Retracted science and the retraction index. Infect. Immun. 79: 3855-3859 (2011).
  16. Fang, F.C., et al., Misconduct accounts for the majority of retracted scientific publications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A . 109: 17028-33 (2012).
  17. Bustin, S.A., et al., The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55:611-622 (2009).
  18. Bustin, S.A., Benes, V., Garson, J., et al. The need for transparency and good practices in the qPCR literature. Nat Methods 10: 1063-1067 (2013).
  19. Huggett, J.F., et al., Guidelines for Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59: 892-902 (2013).