合成肽的处理和储存

使用合成肽最具挑战性的一个方面是确定溶解肽的最佳溶剂。下文将提供正确储存、处理和溶解合成肽的一般指南。


 冻干肽的储存

冻干肽在环境温度下运输,并且能保持稳定数天至数周。如要长期储存,则应储存在-20°C或更低温度,远离强光。

暴露于水分会降低冻干肽的长期稳定性。在使用肽之前,从冷藏中取出,使肽平衡至室温,然后取下容器的盖子。这将减少吸收周围大气中存在的水分。


 溶解肽

能够溶解所有冻干肽、同时还能在生物测定中保持其完整性和相容性的通用溶剂是不存在的。选择最佳溶剂可能是“反复试验”过程的结果。在适用的情况下,建议首先尝试通过冻干相对容易去除的溶剂,以防最初试用的溶剂不溶解肽。在溶解整个肽样品之前,务必先只测试一部分肽。以下步骤提供了溶解肽的一般指南。对于所使用的任何溶剂,在尝试这些方法之前,应考虑您的测定对溶剂的耐受性。

 确定溶解特性

评估肽的氨基酸组成是了解肽的溶解特性的初步工具。肽中离子电荷的数量和类型决定了其在水性溶液中的溶解度。通常,肽所具有的带电残基越多,就更易于溶于水性溶液。请注意,由于肽通常在pH 6-8时比在pH 2-6时具有更多电荷,因此它们在接近中性pH下更可能更好地溶解。例外是肽序列非常疏水并且倾向于凝聚。虽然序列的疏水性可以是凝聚的主要原因,但肽也会通过广泛的氢键键合凝聚或“凝胶化”。

按照以下指南确定肽是碱性、酸性还是中性:
第1步:为每个酸性残基(D、E和C-末端COOH)分配一个-1值。
第2步:为每个碱性残基(K、R和N末端NH2)分配一个+1值。
第3步:在pH <6时为每个H残基分配一个+1值,在pH> 6时分配值为零。
第4步:将这些值相加计算出肽在pH7时的总电荷数(所有D、E、K、R、C-末端COOH和N-末端NH2),从而得到肽的总净电荷


 带电肽的溶解方法

根据上述指南,使用以下方法确定肽的总体溶解类型:

酸性肽(净电荷为负)

如果肽的总净电荷为负,则肽被认为是酸性的。如果肽是酸性的,且/或如果肽在pH 7下的总电荷数大于残基总数的25%,则加入少量0.1 M碳酸氢铵来溶解肽,然后用水稀释到所需的浓度。确保肽溶液的最终pH值约为7,根据需要调节pH值。

碱性肽(净电荷为正)

如果肽的总净电荷为正,则肽被认为是碱性的。如果肽是碱性的,且/或如果肽在pH 7下的总电荷数介于残基总数的10%至25%,则加入少量25%的乙酸来溶解肽,然后用水稀释到所需的浓度。

中性肽(净电荷为零)

如果肽的总净电荷为零,则肽被认为是中性的。如果电荷总数大于残基总数的25%,则使用酸性肽的溶解方法。

其他考虑因素

如果肽的总电荷数小于残基总数的10%,则建议使用有机溶剂。

在尝试更强溶剂之前,超声处理肽溶液以确认肽不溶于所选溶剂。超声处理增强溶解作用,将固体肽破碎成更小的颗粒。如果超声处理后溶液凝胶化,出现混浊或有可见颗粒,则肽未完全溶解而是悬浮。这表明需要更强的溶剂。如果肽不溶解,则冻干并除去挥发性缓冲液。样品干燥后,可以在同一样品上测试另外的溶剂。


 疏水/不带电肽的溶解方法

对于含有大于50%疏水残基的肽序列,带电氨基酸含量低于25%的中性肽,和/或带电氨基酸含量低于10%的肽,建议使用有机溶剂。建议使用乙腈(ACN)、二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)。添加离液序列高的化合物,如盐酸胍或尿素,可以通过破坏氢键网络促进破坏疏水相互作用或减少肽的“胶凝”。在选择过程中,应考虑您的测定对这些有机或离液序列高的试剂的耐受性。含有Cys(C)和Met(M)的肽序列在DMSO中不稳定。重要的是将肽完全溶解在最初使用的溶剂(例如乙酸、乙腈、DMSO或DMF)中,因为肽溶解到这些溶剂中的速率通常高于水/溶剂混合物中的溶解速率。如果首先用水/溶剂混合物来溶解肽,最终可能会向肽样品中不必要地加入大量非水性溶剂。也可能有必要使用超声处理来促进肽完全溶解。

当肽溶解于初始溶剂中后,特别是溶解于有机溶剂中的那些溶剂中后,将肽溶液逐滴缓慢地加入到缓冲溶液中,一边加入,一边轻轻匀速搅拌,以稀释肽。这种方法可以防止肽在水性溶液中的局部浓缩,这种局部浓缩有可能导致肽沉淀。这样做的好处是,可以在视觉上观察到肽沉淀,并相应地采取措施。


 制备工作原液

将肽溶解于无菌蒸馏水或无菌稀乙酸(0.1%)中(视情况而定),制备浓度高于实验测定所需浓度的肽原液。肽原液可以用测定缓冲液进一步稀释。

注意:如果最初使用不含非挥发性盐和/或有机溶剂的测定缓冲液来溶解肽并且未能溶解,则可能难以将肽回收。如果肽不溶于水或乙酸,则可以将肽溶液冻干回其原始状态。肽被冻干后,可以尝试别的溶剂。