原代细胞培养

 细胞培养

细胞是生物体的基石,拥有高度代表整个生物体的信息。细胞培养是一种技术,通过该技术可以独立于整个生物体研究细胞的行为。在该方法中,细胞取自动物或植物,并在受控的有利人工条件下生长。

  • 细胞培养过程包括从动物或植物中取出细胞,以及随后在有利的人工环境条件下生长。细胞可以直接从组织中取出并在培养前通过酶或机械方法解聚,或者可以来自已经建立的细胞系或细胞株。
  • 细胞的亚培养或传代(或分裂)培养是指确保细胞存活并在培养条件下长时间生长的过程。

广义上讲,有3种类型的细胞培养程序:

  • 原代细胞培养:从组织中直接提取原代细胞并加工以在培养条件下建立它们。
  • 二次细胞培养:原代细胞的亚培养导致二次培养。虽然它具有已建立细胞系的一些特征(下图),但它不会无限分裂。 
  • 细胞系:从单个细胞发育并具有统一遗传组成的细胞培养物称为细胞系。根据寿命,细胞系分为两种类型:
    • 有限细胞系 — 有限细胞系的寿命有限,约为20-80次群体倍增。成长缓慢,典型的倍增时间为24-96小时。
    • 连续细胞系 — 连续培养由单细胞类型组成,可在培养物中连续繁殖,用于有限数量的细胞分裂。为了使它们无限生长,通过病毒癌基因或通过化学处理转化连续细胞系。它们表现出倍性(非整倍性或异倍性)。生长速度很快,典型的倍增时间为12-24小时。

 原代细胞培养

原代培养物的来源是切除的动物组织,其作为外植体培养物、悬浮液或单层培养,并在体外维持。对切下的组织进行酶处理,并将解离的细胞在适当的条件下在培养基中培养,直至达到足够的数量。分离的原代细胞有两种类型:

贴壁细胞/锚定依赖细胞 — 需要附着生长的细胞称为锚定依赖细胞。贴壁细胞主要来自器官组织(如肾脏),在那里它们不能移动并嵌入结缔组织中。

悬浮细胞/锚定独立细胞 — 不需要附着即可生长或不附着于培养容器表面的细胞称为锚定独立细胞 / 悬浮细胞。所有悬浮培养物均来自血液系统的细胞(因为这些细胞在体外悬浮于血浆中,例如淋巴细胞)。

用于研究的最流行的原代细胞是上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、内皮细胞、肌肉细胞、造血细胞和间充质干细胞。培养物最初是异质的(代表组织中存在的细胞类型的混合物)并且可以仅在有限的时间内在体外维持。可以通过称为转化的体外过程操纵原代细胞进行无限次传代培养。转化可以自发发生,也可以化学或病毒诱导。当原代培养经历遗传转化(在提供有适当的新鲜培养基和空间的情况下)时,它们无限分裂并变得永生。


 原代细胞与连续细胞系的比较

 

性质 原代细胞 连续细胞系
寿命和细胞增殖 是有限的(即限于较少次数的细胞分裂) 当处理得当时是无限的(即长时间,大约30次细胞分裂)
一致性 捐赠者和制剂之间存在差异 差异很小
遗传完整性 通过细胞倍增保留体内组织遗传组成 随着细胞分裂而发生遗传漂移(未知突变)
生物学相关性 较接近地模仿体内细胞的生理学 相关性随着细胞分裂而随时间漂移(生物学相关性很低)
易于使用性(冻融和使用) 需要优化的培养条件和谨慎处理 存在完善的条件和稳健的实验方案
花费的时间和费用 需要较多时间和较少细胞 需要较少时间和较多细胞

研究中的连续细胞系

  • 是用于研究哺乳动物细胞生物化学和细胞生物学分析的复杂生物系统的模型系统。不朽特性使它们适合于实验中的再现性
  • 在更大规模的连续细胞中研究化合物的毒性和蛋白质的生产具有成本效益且易于使用
  • 在诊断、研究、开发和工业应用中用于病毒分离和鉴定
  • 用于基因表达研究,因为连续细胞系更容易克隆、操作和维持。

研究中连续细胞系的缺点

尽管连续细胞系易于处理,但存在明显的缺点,其限制了将实验结果外推至体内条件。

  • 随着细胞分裂,总突变和染色体异常增加
  • 正常细胞表型和早期疾病进展的指标不佳
  • 细胞系功能与健康或患病的其他细胞功能无直接关联

 原代细胞培养与连续细胞系的相关性

原代细胞培养越来越多地被用作细胞和分子生物学的主要工具,为研究细胞的正常生理学和生物化学(例如代谢研究、衰老、信号传导研究)、药物和有毒化合物对细胞的影响、诱变和致癌作用等,提供了优秀的模型系统。它还用于药物筛选以及大规模开发生物化合物(例如疫苗、治疗性蛋白质)。

  • 模型系统:由于原代细胞是非转化的,非永生化的,因此它们非常接近地模拟生物模型并产生更多生理学上显著的结果。这些细胞可作为研究细胞生物学和生物化学的模型系统,用来研究细胞与致病因子(如细菌、病毒)之间的相互作用、药物的作用、细胞衰老过程、细胞信号和代谢调节。在许多情况下,原代细胞的使用使研究人员避免了使用动物模型所涉及的复杂情况(可用性、成本和伦理)。
  • 癌症研究:原代细胞可以暴露于辐射、化学物质和病毒而癌变。因此,可以研究癌症的机制和原因以及改变的信号传导途径。它还可用于测定癌细胞的有效药物。在这个领域,还可以研究癌症治疗(化疗和放疗)对正常细胞的副作用。
  • 病毒学:可以研究病毒的检测、分离、生长和发育周期。原代细胞也可用于研究感染模式。
  • 药物筛选和毒性测试:原代细胞培养用于研究新药(研究效果和安全剂量)和/或药物载体(纳米颗粒)的细胞毒性。它可用于以工业规模合成或生产各种生物分子。这在制药工业中特别有用。现正在开发各种使用原代细胞的基于细胞的治疗产品的研究项目。6 用原代(动物细胞)培养物代替动物模型来测试新药、化妆品和化学品的效果。它们还用于确定新药的最大允许剂量。
  • 疫苗生产:原代动物细胞用于生产病毒,这些病毒用于生产疫苗(例如脊髓灰质炎、狂犬病、水痘、麻疹和乙型肝炎等致命疾病的疫苗均使用动物细胞培养生产),避免使用动物模型。
  • 基因工程:原代(动物)细胞培养物用于生产具有重要的商业价值的基因工程蛋白,如单克隆抗体、胰岛素、激素等。
  • 组织或器官替换:原代(动物)细胞培养可用作组织或器官的替代品。目前正在研究利用原代细胞重建受损组织或更换非功能性细胞或组织。正在用胚胎和成体干细胞培养进行器官培养技术的开发和研究。这些细胞具有分化成许多不同类型的细胞和器官的能力。通过控制这些细胞的发育和分化,我们能够治疗各种疾病。
  • 产前诊断:提取孕妇的羊水,培养细胞进行染色体异常研究,使用核型分析进行基因研究,并用于早期发现胎儿疾病。
  • 干细胞治疗:从骨髓、血液或胚胎中分离干细胞即涉及原代细胞培养。患者自身的干细胞或来自供体的干细胞在体外生长以产生足够的细胞,即可用于再生组织或替换功能缺陷的细胞。这是一个正在探索的领域,研究的目的是设计治疗方法治疗遗传性疾病、脊髓损伤、退行性疾病和癌症。

 来自Cell Applications的原代细胞

Sigma-Aldrich推出了一系列来自Cell Applications的人类和动物原代细胞和培养基。从脂肪生成到人畜共患肠道疾病,您的研究可以受益于人类原代细胞和动物原代细胞。用于神经元、多能干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞(T细胞、B细胞)、成骨细胞等。我们的原代细胞具有如下特点,是您研究的理想选择:

  • 高纯度和低传代
  • 严格的质量控制
  • 细胞来自范围广泛的组织和物种
  • 匹配集来自同一供体
  • 最大的灵活性
  • 完备的试剂盒随需随用

 预先筛选的原代细胞

供体来源的原代细胞中存在的以及传代培养操作中所造成的差异性,是研究细胞信号传导途径的研究人员所面临的主要挑战。在开始进行信号传导研究之前,研究人员一般会根据细胞对常见刺激的敏感性来筛选细胞。来自Cell Applications的预先筛选的细胞可以节省宝贵的资源,因为它们可以激活主要的信号通路。

  • 内皮细胞:针对血管生成和VEGF信号进行了预先筛选
    我们提供最常用的人内皮细胞,例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人微血管内皮细胞(HMVEC)和人主动脉内皮细胞(HAOEC)。所有这些细胞都进行了预筛选,以证明刺激依赖性血管生成和关键内皮细胞信号传导途径(VEGFR、Akt、MAPK的磷酸化,以及Tie2、eNOS、Axl和Etk / Bmx的表达)。
  • 前脂肪细胞:针对脂肪生成信号进行了预先筛选
    通过诱导人原代前脂肪细胞的分化来制备脂肪细胞的原代培养物,并且预先筛选主要脂肪细胞标志物的表达,例如PPARg(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、C/EBPa(CCAAT/增强子结合蛋白α)、IR(胰岛素受体)、ACCa(乙酰辅酶A羧化酶α)、GSK-3b(糖原合成酶激酶-3-β)和脂联素。
  • 骨骼肌细胞:针对胰岛素和AMPK信号进行了预先筛选
    预先筛选的人骨骼肌细胞(HSkMC)从腿筋的骨骼肌中分离。它保留了骨骼肌的形态、生化和代谢特征。这些细胞可以经历分化以展示肌动蛋白和肌球蛋白肌丝。专门针对功能性AMPK和胰岛素信号传导通路对它进行了测试。

 为什么选择Cell Applications?

再现性

  • 直接从新鲜组织中分离出来的原代细胞在生理上是相关的,但对于分离和培养条件却过分地挑剔。大批量生产的多用途培养基,如DMEM和RPMI,以及永生化细胞系(HeLa、HEK 293、MCF-7、CACO-2、JURKAT、U937、CHO、COS-7等),虽然在生命科学研究中非常重要,但由于细胞系固有的遗传改变,可以导致假阳性和假阴性、次优细胞 / 培养基配对、细胞生长不良、以及错误数据。我们拥有一批具有博士学位的员工,他们对各种独特的组织、物种和细胞类型具有极为丰富的专业知识。
  • 非标准化实验方案的差异很大,取决于人员、实验方案、实验室、材料、试剂、细胞培养塑料材料、甚至实验室/水浴温度、湿度、一年中的时间以及HVAC系统。通过选用我们的原代细胞和培养基产品,可以避免这些变化因素导致数据不一致、意外成本、重复操作和项目延迟。
  • 原代细胞分离技术常会出现并非罕见的表型不一致、污染、生长不良、分离物中含有不需要的细胞类型、以及由于技术不当和非优化培养基导致的细胞死亡。与DIY原代细胞分离相比,由我们使用小量专用培养基精心分离出的生理相关原代细胞更具成本效益。

质量和可靠性

  • 来自Cell Applications的原代细胞和培养基产品均通过严格的SOP生产,并通过严格的质量控制、测试和认证,因此操作规程一致。我们获得了FDA 21 CFR 第820部分、以及现行医疗器械良好生产规范关于人类和动物细胞培养基制造与包装的认证。此外,CAI的管理系统已经过ISO 9001:2008管理体系、标准和指引关于研究用人类和动物细胞及相关产品的制造和供应的评估与认证。这些认证证明了我们对产品质量和客户要求的承诺,除了对学术界、政府和研究机构的支持之外,我们还比以往更加重视支持制药、生物技术和消费品行业的研发计划。
  • 独立第三方在加利福尼亚州圣地亚哥的Cell Applications总部进行定期审核,以评估是否符合众多标准,包括记录、统计技术以及对流程、设计、生产、标签、包装、文档和采购的控制。他们评估我们的产品标识、可跟踪性、验收、处理、存储和分销活动。还审查对不合格产品的纠正及预防措施。

 原代细胞培养

生长要求

原代细胞可以悬浮或贴壁生长。一些细胞天生存在于悬浮状态,而不附着于表面(例如来自外周血的那些细胞)。还有一些细胞系经过修饰,能够在悬浮培养中存活,它们的生长密度高于贴壁培养条件所允许的密度。对于锚定依赖性原代细胞,贴壁细胞(如实体组织)需要贴附一个表面才能在体外适当生长。这些细胞大多在平坦的未包被的塑料容器中培养,但有时使用包被有细胞外基质(例如胶原蛋白和层粘连蛋白)组分的微载体可以提高粘附性,并提供生长和分化所需的其他信号。细胞培养基由补充有适当生长因子和细胞因子的基础培养基组成。细胞在细胞培养箱以合适的温度和气体混合(对于哺乳动物细胞,通常为37℃,5% CO2)生长和维持。培养条件视细胞类型的不同而有很大差异。生长培养基的pH、葡萄糖浓度、生长因子和其他营养素的存在,可以随细胞类型的不同而不同。

在设置原代培养期间,必须在生长培养基中包含抗生素,以抑制从宿主组织引入的污染。使用的抗生素可能包括庆大霉素、青霉素、链霉素和两性霉素B的混合物。但是不建议长期使用抗生素,因为长期使用某些试剂(如两性霉素B)可能对细胞有毒。

分离后,保持原代细胞的活力非常重要,因为它们中的大多数经历了衰老过程,并且经过一定次数的群体倍增后会停止分裂。对于细胞的长期生存能力,优良的细胞培养处理技能以及适当的培养条件(即生长培养基、温度、气体混合物、pH、生长因子浓度、营养物和葡萄糖的存在)是必不可少的。用于补充培养基的生长因子通常来自动物血液(血液衍生成分具有污染的可能性),建议尽可能减少或避免使用这些成分。使用无菌技术也是必要的。

细胞汇合度

细胞汇合度通常是指附着的细胞所栖息的培养容器面积的百分比。例如,100%细胞汇合度意味着表面区域被细胞完全覆盖,而50%汇合度意味着大约一半的表面被覆盖。它是在原代细胞培养中追踪和评估的重要且必要的参数,因为各种细胞类型要求不同的汇合终点,在汇合终点,需要对它们进行传代培养。

维持期及传代培养

当分离的细胞附着在培养皿的表面时,细胞的维持阶段开始。细胞附着通常在培养开始后约24小时完成。当细胞达到所需的细胞汇合度并且正在活跃增殖时,就需要进行传代培养。这是在达到100%汇合度之前传代培养原代细胞培养物的最佳时间,因为汇合后细胞可能会经历分化,并且在传代后表现出较慢的增殖。

锚定依赖性细胞以单层生长,需要用适当的培养基定期进行传代培养,以维持指数生长。单层的传代培养涉及胞间和胞内与附着表面之间键的断裂。大多数贴壁原代细胞需要消化它们的蛋白质附着键,或用低浓度的蛋白水解酶(例如胰蛋白酶 / EDTA)从单层或相关组织上分离。在细胞解离并分散成单细胞悬液后,将它们计数并稀释至适当浓度,然后转移至新鲜的培养容器(培养基的组成随细胞类型的不同而不同),在那里它们将重新附着并分裂。

细胞计数

血细胞计数器通常用于估计细胞数和确定细胞活力(可以使用排除染料,例如台盼蓝或赤藓红B)。血细胞计数器是一种相当厚的玻璃显微镜载玻片,有一个矩形凹槽。凹槽有激光精确蚀刻的垂直线网格。网格的面积和凹槽的深度是已知的。因此,可以计算特定体积的液体中的细胞数量,从而计算液体的总体细胞浓度。

另外有自动细胞计数器,能够进行准确、快速的细胞计数。

冷冻保存和恢复

冷冻保存是用低温保存结构完整的活细胞的过程。正确地冷冻保存和解冻原代细胞极为重要,以使每个过程中细胞的损害和死亡降至最低。对于人细胞,一般通过使用冷冻保护剂,例如DMSO或甘油(在正确温度下并且以受控的冷冻速率冷冻)来实现。对于大多数原代细胞,可以在补充有10% FBS和10% DMSO的80%完全生长培养基的混合物中实现冷冻保存。冷冻过程需要以每分钟降低1℃的速度缓慢进行,以最大限度地减小细胞内冰晶的形成。冷冻培养物需要储存在液氮(-196℃)或-130℃以下的气相中。

解冻冷冻保存的细胞的方法是将冷冻细胞浸入37℃水浴中约1至2分钟,这是一个快速完成的过程。应注意不要在解冻后离心原代细胞(因为在它们从冷冻保存中恢复的过程中极易受损伤)。解冻后最好立刻接种细胞,并且让培养物在最初的24小时内附着。1

在开始培养冷冻保存的原代细胞时,一旦细胞附着,必须立刻除去用过的培养基(因为DMSO对原代细胞有害,并且可能导致解冻后活力下降)。

原代细胞培养面临的挑战:

  • 污染:携带到培养物的原代组织污染。
  • pH值变化:这可能是由于培养基中的盐分不正确、细菌或真菌污染、碳酸氢盐缓冲不足、二氧化碳张力不正确等造成。
  • 最佳贴壁:培养基附着因子不足或不存在,污染,或者细胞胰蛋白酶化过度。
  • 生长缓慢:原因包括培养基pH值的变化,促进必要生长的组分/因子耗尽,有少量污染,试剂储存不当等。
  • 细胞死亡:温度波动,不存在CO2,解冻和/或冷冻保存过程中细胞损伤,毒性代谢物浓度增加,培养基渗透压不平衡导致细胞存活数减少。
  • 沉淀:(无pH的变化):在pH不变的情况下,培养基中出现沉淀可能是因为使用了冷冻培养基,在用去垢剂洗涤时残留有磷酸盐,而使粉末状培养基成分发生沉淀。
  • 细胞结块:悬浮细胞可能由于钙、镁离子的存在,或由于细胞裂解和DNA释放(过度用蛋白水解酶消化)而结块。
  • 造成差异:使用不同的试剂和培养基,造成用原代细胞获得的数据存在差异。不同的使用者操作方法的不同亦可造成差异。

 原代细胞培养的产品列表

原代细胞

培养基

试剂


 原代细胞的优缺点

 

优点 缺点
原代培养的使用避免了针对动物实验而提出的许多道德上的反对意见,允许在人体组织上进行在体内不可能进行的实验。 原代细胞比其他细胞系需要更多的时间来生长,即使在最佳生长条件下它也具有有限的生长潜力并最终衰老和死亡。
原代细胞的使用提供了比细胞系更相关的结果。预先筛选的原代细胞是非常接近地代表体内信号传导的良好模型。 取自不同供体的细胞对促炎细胞因子的反应表现不同(除非它们被预先筛选)。2 在培养条件下不存在体内条件下存在的代谢调节机制的生长。
原代细胞具有成本效益,因为它们有助于减少体内研究所需的动物模型的开支。 虽然比动物模型便宜,但分离和培养的成本通常过高。组织培养可能并不总是可行。如果不保持最佳培养条件,原代细胞的特征可随每次后续传代而改变。