蛋白质表达系统

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 引言

基因工程和克隆的发展为研究领域开辟了表达和分离异源蛋白质的许多可能性。技术上巨大进步使得能够大规模表达和分离重组蛋白。然而,对于酶、抗体或疫苗生产等大规模应用,所需蛋白质的量相当高。在这种情况下,表达蛋白质的系统必须易于培养和维持,生长迅速,并能产生大量蛋白质。此外,哺乳动物蛋白质还经历各种翻译后修饰。这些要求导致蛋白质表达系统的发现。各种蛋白质表达系统是细菌、酵母、昆虫或哺乳动物系统。基因工程和克隆的发展为研究领域开辟了表达和分离异源蛋白质的许多可能性。技术上巨大进步使得能够大规模表达和分离重组蛋白。然而,对于酶、抗体或疫苗生产等大规模应用,所需蛋白质的量相当高。在这种情况下,表达蛋白质的系统必须易于培养和维持,生长迅速,并能产生大量蛋白质。此外,哺乳动物蛋白质还经历各种翻译后修饰。这些要求导致蛋白质表达系统的发现。各种蛋白质表达系统是细菌、酵母、昆虫或哺乳动物系统。

以下因素决定了用于生产重组蛋白的表达系统的类型:

  • 表达蛋白质所花的时间
  • 处理表达系统的容易程度
  • 所需蛋白质的量
  • 蛋白质的质量
  • 翻译后修饰的类型,二硫键的数量
  • 表达蛋白质的目的地

在表达系统中表达重组蛋白的过程需要以下信息/组分。

  • 鉴定编码目的蛋白质的基因
  • 从各自的mRNA产生cDNA
  • 选择合适的表达载体以插入基因序列
  • 选择可以表达载体的合适系统
  • 适当的筛选和扩大方法

涉及产生所需重组蛋白的核心步骤在各种表达系统中是相似的(图1)。

优化蛋白质表达系统以产生所需重组蛋白质的步骤

图1:优化蛋白质表达系统以产生所需重组蛋白质的步骤


 细菌蛋白质表达系统 — 大肠杆菌

由于倍增时间短,细菌作为表达重组蛋白的快速且简单的系统起作用。培养它们所需的培养基并不昂贵,适合扩大生物生产的方法也很直接简单。最广泛使用的宿主系统是大肠杆菌,因为人们对它的遗传学、基因组序列和生理学已经掌握了充分的知识。遗传操作很容易,并且还可以生长到高密度,适合大规模发酵。然而,大肠杆菌的细胞壁含有毒性热原,并且在使用前可能必须对表达的蛋白质进行广泛测试。 

图2:细菌蛋白质表达系统 — 大肠杆菌

使用大肠杆菌表达蛋白质涉及以下步骤:

  • 使用感受态大肠杆菌(货号:CMC0001CMC0004CMC0014)细胞来摄取目标DNA序列
  • 将DNA整合到细菌基因组中,或者环化DNA序列从而作为质粒存在
  • 用选择标记(抗生素)(货号:L5667L0168L0543L0418L8795)选择经过转化的大肠杆菌
  • 所选择的大肠杆菌扩大规模后在适当的培养基中表达,可用培养基包括传统的LB选择(产品号:L2542L3522L3147)或EnPresso™ B生长系统(产品号:B11001
  • 胞内蛋白质 / 分泌蛋白质的分离和纯化

特点

  • 培养方法成本低
  • 系统灵活 — 可以携带具有多个启动子、标签和限制性位点的质粒
  • 易于扩大规模并产生更高的蛋白质产率

 酵母蛋白表达系统 — 酿酒酵母

高度发达的遗传系统、易用性、较低的时间投入与成本,使酿酒酵母成为重组蛋白表达和生产的一种颇具吸引力的生物。酵母能够携带特别设计的质粒,并且这种能力在重组蛋白质表达系统中很有价值。使用的质粒由可用于插入目标基因序列的限制性位点组成。用质粒转化酵母产生所需的蛋白质并且可以适当地按比例放大规模。

酵母蛋白表达系统 — 酿酒酵母

图3. 酵母蛋白表达系统 — 酿酒酵母

使用酿酒酵母表达蛋白质涉及以下步骤:

  • 使用感受态大肠杆菌细胞来摄取目标DNA序列(货号:CMC0001CMC0004CMC0014
  • 将DNA整合到细菌基因组中,或者环化DNA序列从而作为质粒存在
  • 用选择标记(抗生素)(货号:L5667L0168L0543L0418L8795)选择经过转化的大肠杆菌
  • 所选择的大肠杆菌在适当的培养基中表达,可用的培养基包括传统的LB选择(产品号:L2542L3522L3147)或EnPresso™ Y已知成分培养基(产品号:Y22001
  • 分离DNA或质粒
  • 转化为酵母(酵母转化试剂盒,货号:YEAST1
  • 筛选转化体,将DNA整合到酵母染色体中
  • 在适当的培养基(货号:Y1375Y1501Y1751Y2001Y1376Y0750)中选择和扩大高表达酵母克隆
  • 胞内蛋白质 / 分泌蛋白质的分离和纯化

特点

  • 培养方法成本低
  • 适用于胞内蛋白质和分泌蛋白质
  • 提供蛋白质的真核翻译后糖基化,尽管它导致高


 昆虫细胞表达系统 — Sf9和Sf21

来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9和Sf21的细胞系常被用作重组蛋白表达系统。杆状病毒是一种溶菌性dsDNA病毒,在鳞翅目昆虫的细胞中常规扩增。它在脊椎动物中是非感染性的,其启动子在哺乳动物细胞中无活性。

昆虫细胞表达系统 — Sf9和Sf21

图4. 昆虫细胞表达系统 — Sf9和Sf21

使用杆状病毒 / 昆虫细胞表达蛋白质涉及以下步骤:

  • 使用感受态大肠杆菌细胞来摄取目标DNA序列(货号: CMC0001CMC0004CMC0014
  • 将DNA整合到细菌基因组中,或者环化DNA序列从而作为质粒存在
  • 用选择标记(抗生素)(货号:L5667L0168L0543L0418L8795)选择经过转化的大肠杆菌
  • 所选择的大肠杆菌在适当的培养基(货号:L2542L3522L3147)中表达
  • 分离DNA或质粒
  • 制备含有病毒粒子增殖和形成所需病毒基因的二级质粒
  • 将表达质粒和二级质粒共转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中
  • 纯化重组病毒原种
  • 扩增病毒,并进行额外的噬斑测定,以增加重组病毒原液的滴度
  • 用高滴度重组病毒原种感染昆虫细胞
  • 胞内蛋白质 / 分泌蛋白质的分离和纯化

特点

  • 重组蛋白在细胞溶解前的溶解周期的最后阶段高度表达
  • 适合产生胞质蛋白和分泌蛋白
  • 有效地产生蛋白质中的二硫键
  • 提供哺乳动物细胞中发现的大多数翻译后修饰

 

 哺乳动物细胞表达系统 — HEK293和CHO

使用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的主要挑战是效率低,所表达的蛋白质水平低。然而,诸如HEK293和CHO的细胞系已经分别被开发为有效的瞬时和稳定表达系统。使用脂质体、磷酸钙或PEG作为转染试剂瞬时转染HEK293细胞。虽然瞬态表达相对容易和简单,但扩大规模却在技术上存在挑战性。CHO细胞通常用于稳定表达大量重组蛋白。该方法包括用目标基因和DHFR选择盒转染DHFR缺陷型CHO细胞。然后在甲氨蝶呤存在下筛选转染的细胞以获得稳定转染的细胞库。选择和扩展过程需要2-3个月。 

哺乳动物细胞表达系统 — HEK293和CHO

图5. 哺乳动物细胞表达系统 — HEK293和CHO

使用哺乳动物细胞的瞬时或稳定蛋白质表达涉及以下步骤:

  • 使用感受态大肠杆菌细胞来摄取目标DNA序列(货号:CMC0001CMC0004CMC0014
  • 将DNA整合到细菌基因组中,或者环化DNA序列从而作为质粒存在
  • 用选择标记(抗生素)(货号:L5667L0168L0543L0418L8795)选择经过转化的大肠杆菌
  • 在CloneStable™中保存克隆(此步骤为可选步骤)
  • 所选择的大肠杆菌在适当的培养基(货号:L2542L3522L3147)中表达
  • 分离DNA或质粒
  • X-tremeGENE™ 转染试剂将表达质粒转染至哺乳动物细胞
  • 选择稳定的克隆
  • 扩展克隆用于瞬时批次表达,或者扩展克隆2-3个月用于稳定表达
  • 胞内蛋白质 / 分泌蛋白质的分离和纯化

特点

  • 瞬时表达简单、快速
  • 提供哺乳动物细胞中发现的所有翻译后修饰
  • 稳定的转染可实现更高的产量、可扩大性及可再现生产

下表比较了四种蛋白质表达系统及其各自的优缺点:

哺乳动物细胞表达系统 — HEK293和CHO

图5. 哺乳动物细胞表达系统 — HEK293和CHO


使用哺乳动物细胞的瞬时或稳定蛋白质表达涉及以下步骤:

  • 使用感受态大肠杆菌细胞来摄取目标DNA序列(货号:CMC0001CMC0004CMC0014
  • 将DNA整合到细菌基因组中,或者环化DNA序列从而作为质粒存在
  • 用选择标记(抗生素)(货号:L5667L0168L0543L0418L8795)选择经过转化的大肠杆菌
  • 在CloneStable™中保存克隆(此步骤为可选步骤)
  • 所选择的大肠杆菌在适当的培养基(货号:L2542L3522L3147)中表达
  • 分离DNA或质粒
  • X-tremeGENE™ 转染试剂将表达质粒转染至哺乳动物细胞
  • 选择稳定的克隆
  • 扩展克隆用于瞬时批次表达,或者扩展克隆2-3个月用于稳定表达
  • 胞内蛋白质 / 分泌蛋白质的分离和纯化

特点

  • 瞬时表达简单、快速
  • 提供哺乳动物细胞中发现的所有翻译后修饰
  • 稳定的转染可实现更高的产量、可扩大性及可再现生产
  • 下表比较了四种蛋白质表达系统及其各自的优缺点:

蛋白质表达系统 优点 缺点
大肠杆菌 快速表达 没有真核翻译后修饰
较便宜 有些蛋白质没有正确折叠
流程规模放大简单 蛋白质很少被分泌
遗传学特征鲜明
酿酒酵母 表达速度中等 与典型的哺乳动物蛋白质相比,蛋白质的特征N-连接聚糖结构是不同的
适用于分泌蛋白质和胞内蛋白质 需要使用酵母分泌信号肽
较便宜 需要加强的安全预防措施
大多数蛋白质折叠和翻译后修饰都是可能的
杆状病毒 / 昆虫细胞 表达速度中等 与典型的哺乳动物蛋白质相比,蛋白质的特征N-连接聚糖结构是不同的
适用于分泌蛋白质、膜蛋白质和胞内蛋白质 昂贵
大多数蛋白质折叠和翻译后修饰都是可能的 难以扩大规模
哺乳动物细胞(瞬时表达) 表达速度中等 昂贵
适用于分泌蛋白质和膜蛋白质 胞内蛋白质的产量低
所有蛋白质折叠和最正宗的翻译后修饰都是可能的 难以扩大规模
哺乳动物细胞
(稳定表达)
所有蛋白质折叠和最正宗的翻译后修饰都是可能的 昂贵
适用于分泌蛋白质和膜蛋白质 胞内蛋白质的产量低
难以扩大规模
表达时间长

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