定量PCR

正如简介及历史大事记聚合酶链反应中所述,PCR目前被认为是应用于分子生物学研究的最有用的技术。这主要是由于其能够将靶核酸序列(模板;基因组DNA、gDNA或互补DNA、cDNA)扩增数百万倍。当与定量PCR(正式名称为定量实时PCR,qPCR)检测结合使用时,它可用于估计样品中起始材料的量。由于在反应进行的过程中即可检测到产物,因此qPCR比传统的终点PCR具有更宽的动态分析范围;在一次运行中即可检测到单个拷贝至大约1011个拷贝。定量实时PCR和随后的扩增子检测是以闭管形式进行的,因此不需要进行PCR后操作,例如凝胶电泳,因此大大降低了交叉污染的风险。

本章将讨论qPCR的基本原理,并将在定量PCR和数字PCR检测方法中介绍常用的检测化学的机理。


 基本原则

在进行qPCR时,荧光报告染料用来间接测量每个扩增循环期间存在的核酸量。荧光信号的增加与在反应的重复阶段中产生的以指数累积的PCR产物分子(扩增子)的量成正比(参见聚合酶链反应)。报告分子被归类为:双链DNA(dsDNA)结合染料,与引物缀合的染料,或其他染料缀合的寡核苷酸,称为探针(参见定量PCR和数字PCR检测方法)。

使用dsDNA结合染料,例如SYBR® Green I,代表了最简单的检测化学形式。当在溶液中游离或仅存在单链DNA(ssDNA)时,SYBR Green I 染料发出信号强度低的光。随着PCR的进行和dsDNA的量的增加,更多的染料与扩增子结合,因此信号强度增加。

另外一种方法是,使用探针(或取决于检测方法的设计,可使用两者的组合)可以提高检测特异性水平,该水平高于dsDNA结合染料的检测特异性水平,因为它结合位于引物之间的模板的特定区域。最常用的探针形式是双标记探针(DLP,亦称为水解探针或TaqMan® 探针)。DLP是具有5' 荧光标记的寡核苷酸,例如6-FAMTM ,以及3' 淬灭分子,例如暗淬灭剂之一BHQ® 1或OQ™(参见定量PCR和数字PCR检测方法)。这些探针的设计使其与两种引物之间的模板杂交,并与固有5' 至3' 外切核酸酶活性的DNA聚合酶结合使用。当DLP在溶液中游离时,信号强度低,因为报告染料非常接近淬灭剂基团。随着反应过程中产生更多的模板,更多的探针与模板杂交,而模板又被前进的DNA聚合酶的5' 至3' 外切核酸酶活性切割。随着5' 报告染料释放到溶液中,荧光信号强度增加。使用用不同报告染料标记的探针,可在单个(多重)反应中同时检测和定量多个靶标。

典型的qPCR运行包括重复循环进行交替的温度孵育,参见循环程序3.1。当选用dsDNA结合染料、Molecular Beacons、或Scorpion® 探针作为qPCR的检测化学方法时,通常使用该程序。引物延伸在72°C时最有效,因为这是大多数DNA聚合酶的持续合成的最佳温度。在72℃下,聚合以约100个碱基/秒的速率发生。然而,在较低温度下,仍然存在足以扩增较短模板的持续合成力。qPCR扩增子通常比常规PCR产物短(<200碱基),因此,当使用双标记探针时,延伸通常与在60℃下单步退火相结合(参见循环程序3.2)。

循环程序3.1

使用dsDNA结合染料、Molecular Beacon或Scorpions® 探针进行检测的标准qPCR程序的示例。

  • 初始变性:将反应温度升至95°C,将样品孵育2-10分钟(时间取决于聚合酶的热启动机制),以确保所有复杂靶标(dsDNA)都分离成单链,以便扩增。
  • 循环:
  1. 变性:将反应温度升至95℃持续10秒钟,以熔化所有dsDNA。
  2. 退火:将温度降至60℃ 30秒,以促进引物和探针(如果包括)与模板结合。
  3. 延伸:随后的延伸发生在升高至72℃的温度下,这对于TaqDNA聚合酶的持续合成力是最佳的。延伸的持续时间取决于扩增子大小(每1kb 30秒)。延伸时间取决于所需的扩增子长度以及所用的酶。由于qPCR扩增子很短,因此时间通常为5-30秒。
  • 重复:重复执行步骤1-3,通常为40个循环。

循环程序3.2

用于DLP检测的两步循环qPCR程序的示例。

  • 初始变性:将温度升至95°C,并将反应物孵育2-10分钟(取决于聚合酶的热启动特性)。
  • 循环:
  1. 变性:将反应温度升至95℃持续10秒钟,以熔化所有dsDNA。
  2. 退火和延伸:将温度降低至60℃持续30秒,以促进引物与模板结合,随后,由于在该温度下DNA聚合酶的足够活性而发生延伸。
  • 重复:重复执行步骤1-2,通常为40个循环。
    用实时PCR热循环仪测量反应过程中荧光的变化。专用的实时PCR仪器结合了温度循环与光学单元。光学单元提供合适波长的光,以激发荧光团并检测所产生的发射光。许多现代化仪器都有一个固定的显示屏,或在附近设有计算机显示器,用以跟踪反应的进展(图3.1)。

qPCR分析数据示例。 A)反应的不同阶段。 基线:模板初始浓度低,因此荧光强度太低而不能被检测到,只有背景信号是明显的。 指数:在靶样产量达到检测阈值(显示为红色阈值线)后,在整个指数阶段可以跟踪反应过程。线性:随着模板浓度的增加,可用的DNA聚合酶浓度降低,反应速率降低。 高原:反应处于最大产量期。 B)个体反应的特征在于荧光首先升高到阈值以上的循环,其被称为定量循环(Cq)。如果起始材料丰富,则会在较早的循环中观察到扩增,这种情况中Cq较低。如果起始材料稀缺,则在后续循环中观察到扩增,Cq较高。荧光、Cq和扩增产物的量之间的这种相关性,使得能够在宽动态范围内定量模板。

图3.1. qPCR分析数据示例。 A)反应的不同阶段。 基线:模板初始浓度低,因此荧光强度太低而不能被检测到,只有背景信号是明显的。 指数:在靶样产量达到检测阈值(显示为红色阈值线)后,在整个指数阶段可以跟踪反应过程。线性:随着模板浓度的增加,可用的DNA聚合酶浓度降低,反应速率降低。 高原:反应处于最大产量期。 B)个体反应的特征在于荧光首先升高到阈值以上的循环,其被称为定量循环(Cq)。如果起始材料丰富,则会在较早的循环中观察到扩增,这种情况中Cq较低。如果起始材料稀缺,则在后续循环中观察到扩增,Cq较高。荧光、Cq和扩增产物的量之间的这种相关性,使得能够在宽动态范围内定量模板。


 gDNA靶标的定量和分析

定量实时PCR可以很容易地应用于分析gDNA靶标。这些研究包括基因分型 / SNP测定、甲基化分析、筛选转基因序列、或监测插入和缺失。


 mRNA转录的定量和分析

qPCR的常见应用是基因表达分析,例如,比较对照和处理后样品之间目的基因的mRNA浓度。mRNA可以通过两步或一步RT-qPCR过程加以定量(参见逆转录定量实时PCR详细了解RT反应)。

两步RT-qPCR

逆转录和qPCR反应分别在单独的管中顺序进行。无论是总RNA,还是较少使用的聚(A)+ RNA均可作为起始材料,cDNA是通过延伸生成的,引物包括oligo-dT引物、随机引物、oligo-dT引物/随机引物的混合物、或者使用逆转录酶的基因特异引物。将反应物等分后加入qPCR。

一步RT-qPCR

如果逆转录和qPCR反应组合进一个管,则实验设置就被简化,且污染机会降低,因为不需要进一步处理样品。


 ncRNA转录的定量和分析

大多数非编码RNA长于100个核苷酸,因此,可以通过RT-qPCR以及与mRNA分析所使用的相同的一些技术加以检测和定量。相反,短的非编码RNA,例如微RNA和piwi RNA,基本上是单个PCR引物的长度。因此,在进行qPCR之前需要使用技术将这些短RNA延长。可商购获得的系统中采用两种主要方法:1)使用茎环RT引物,2)聚-A拖尾,然后使用oligo-dT衔接子引物进行RT(图3.2)。Casoldi等人开发的另一种方法是无法商购获得的,它使用衔接分子与样品中的所有RNA连接,并使用特异性引物设计来区分所需的靶标1,2

茎环RT引物法由Applied Biosystems(现名为Life Technologies / Thermo)开发并商业化,用于随后的基于TaqMan探针的qPCR3。如图3.2A所示,RT引物的5' 末端可与其自身的3' 末端的几个核苷酸区域碱基配对,以产生由未配对环分开的碱基配对茎。除了RT引物3' 末端的最后几个核苷酸之外的所有核苷酸都是通用的,即它们在所有miRNA引物中含有相同的序列。从茎延伸3' 的最后几个核苷酸与靶miRNA的3' 末端互补。沿着miRNA模板延伸引物,产生可以用miRNA特异性正向引物和通用反向引物扩增的cDNA,反向引物与茎环RT引物的5' 末端互补。

所有其他商业miRNA qPCR方法,包括我们的MystiCq® 品牌,都使用聚-A拖尾来延长miRNA,如Shi和Chiang所述4。聚(A)聚合酶(PAP)是一种不依赖于模板的酶,催化腺苷残基从ATP转移到任何RNA的3' 末端。然后可以使用oligo-dT引物进行RT,如图3.2B所示。oligo-dT引物在其5' 末端包含衔接子序列,其使得随后能够使用与特定miRNA互补的正向引物和与衔接子序列互补的反向引物进行qPCR。

有两种可商购获得的miRNA的RT和qPCR方法。A)环状引物用于在与miRNA的3' 末端杂交后引发RT步骤。通过环进行PCR延伸,产生组合的miRNA和通用序列,其长度足够进行扩增;B)向miRNA添加聚A拖尾,以提供引物的引发位点,所述引物由oligo-dT束和通用引发序列组成。

 

 

图3.2. 有两种可商购获得的miRNA的RT和qPCR方法。A)环状引物用于在与miRNA的3' 末端杂交后引发RT步骤。通过环进行PCR延伸,产生组合的miRNA和通用序列,其长度足够进行扩增;B)向miRNA添加聚A拖尾,以提供引物的引发位点,所述引物由oligo-dT束和通用引发序列组成。

示图来自牛津大学出版社的核酸研究。经牛津大学出版社许可,通过版权结算中心以书籍/电子书形式转载。

 

两种商业方法都各有优缺点。茎环引发允许进行两步RT-qPCR,而大多数聚-A拖尾法在qPCR之前需要额外的RT步骤。有一些产品可将聚-A拖尾与RT结合在一个反应​​中,用于进行两步PAP拖尾/ RT-qPCR。但是,使用这种方法检测可能不太敏感(根据未发表的内部结果)。相反,聚-A拖尾后接着进行RT可产生稳定的cDNA池,可以立即或在将来的任何时间用于检测任何microRNA、mRNA或其他RNA。使用茎环 / TaqMan方法,需要不同的引物来检测每种miRNA。可以将多个茎环引物添加至相同的RT反应5,并且可以从Life Technologies购买多个miRNA的RT引物池以进行多重RT。然而,这两种方法都不能对后来发现的miRNA进行qPCR检测,也不能对来自相同cDNA的mRNA进行qPCR检测。Castoldi等人1,2所描述的系统是独特的,因为它确实提供了有效方法来检测mRNA前体以及来自相同的总RNA样品、经过完全处理的miRNA分子。


 qPCR要求

仪器

许多qPCR仪器设计用于支持特定范围的应用,例如,ABi 7900仪器具有高通量能力,384孔板自动上样,而Illumina Eco仪器则支持单个48孔板。因此,可选择最合适的仪器满足研究需要。理想的做法是选择具有用户友好软件的仪器,软件执行最想要的功能,并且具有灵活的数据输出方式,以便下游统计分析软件包更易于操作数据。这减少了培训人员所需的时间,分析结果好。所需的其他功能包括一个绝对统一的PCR模块(96个复制孔的绝对最大偏差为1Cq = 2倍),以及一个光学系统,可以在很宽的波长范围内灵敏、均匀地激发和检测发射光。这允许广泛地选择荧光团,并实现多路复用。另外还要考虑的其他特点是与特定耗材相关的运作成本,例如,如果在反应中不使用标准微量滴定板,那么就需要考虑非标准型的上样板或管的方便性。

模板

启动qPCR需要非常少的靶核酸变性(相当于约100 pg的gDNA或cDNA)。为了尽量减少反应抑制剂的污染,应将起始模板量保持在实现精确定量所需的最小值。当起始材料是RNA时,引物设计和DNase I处理将减少可能由gDNA污染产生的信号。

引物

无论是使用dsDNA结合染料还是基于探针的检测化学,设计高质量引物都是qPCR中最关键的实验前步骤之一。有关测定设计的详细讨论,请参见PCR / qPCR / dPCR测定设计。为了最大限度地提高灵敏度和特异性,应包含任何所要求的修饰,例如锁定核酸(参见qPCR检测化学)。

探针

当使用探针作为扩增子检测机制时,检测不到引物二聚体和非特异性产物,但应避免它们,因为它们会降低反应效率。为了最大限度地提高灵敏度和特异性,应选择适合应用的探针类型,并包括任何所需的修饰,如锁定核酸(参见qPCR检测化学

dNTP

标准PCR / qPCR预混液含有dATP、dCTP、dGTP和dTTP。然而,有些可用的混合物用dUTP代替了dTTP。使用dUTP进行的先前反应的产物将含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。所以它们易受尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的切割。因此,事先用UNG孵育后续反应物可防止反应之间的携带污染物。为了有效,实验室中的所有PCR都必须使用dUTP。 

氯化镁(MgCl2)是逆转录酶、Taq DNA聚合酶和Taq DNA 5'至3'核酸外切酶活性所必需的。含有DLP的反应物的最佳Mg2+浓度通常在3 - 6 mM之间。大多数预混液都含有MgCl2,但有时需要优化浓度,因此预混液产品通常包括额外一管纯MgCl2(参见”测定的优化和验证“)。在有些情况下,可能需要不含MgCl2的反应混合物,从而可以使用低浓度,例如使用Scorpions® 探针检测时。

逆转录酶

提供高产量cDNA、同时在高温下保持活性的逆转录酶对RT-qPCR的成功至关重要。高温下的性能有助于去除具有显著二级结构的RNA区域的稳定性,从而易于杂交和随后扩增。当进行一步法RT-qPCR时,高温性能允许使用具有高解链温度(Tm)的基因特异性引物,这增加了反应特异性。当进行两步方案时,重要的是确保酶能够使来自RNA的cDNA具有线性、成比例的产率(关于RT评估的详细内容,参见逆转录)。

Taq DNA聚合酶

与为RT选择最合适的逆转录酶一样,选择合适的聚合酶也至关重要。天然Taq DNA聚合酶的一个基本问题是酶在低温下具有残余活性。由于这种残留的聚合酶活性,非特异性引物结合导致非特异性产物形成。抗体阻断或化学阻断的Taq DNA聚合酶(“热启动”)有助于通过阻止酶活性来纠正这种情况,直到高温变性步骤开始。

缓冲液

缓冲液或反应预混液通常含有dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCl2和稳定剂。取决于检测化学、仪器和反应要求,可能还需要SYBR Green I染料、ROX™、荧光素和惰性加载染料(参见”上样控制染料“)。PCR缓冲液组分和稳定剂通常是制造商专有的。如果单独购买,可以实现最大的灵活性,因为每种成分都可以在反应中单独优化。然而相反,虽然购买将所有成分混在一起的预混液用起来不太灵活,但它提高了批次的一致性和便利性,同时减少了移液步骤,从而减少错误和污染的可能性。

上样控制染料

一些实时PCR热循环仪需要在每个反应中加入诸如ROX的上样染料来控制光学系统的可变性,并标准化信号强度的差异。同样地,一些热循环仪在使用SYBR Green I染料(具有非常低的背景)测定时,需要初始荧光素信号来产生虚拟背景。这些可以在预混液中提供,或作为单独的组分提供以便使用适当的浓度。


 MIQE指南

使用qPCR的一个明显问题是,很容易产生可以很容易地被解释为定量结果的数字。然而,这可能同样具有误导性,因为可能需要质量控制和进一步分析来区分由不适当的测定设计、执行或数据分析产生的可能伪影。在没有充分的质量控制的情况下发表显然很重要的数据,会导致报告不具有生物学或临床相关性,这还是最好的情况,最坏的情况是报告的结果不准确。

从样本采集到qPCR数据分析,qPCR实验过程的每一步都容易受差异的影响6。因此,在样本选择和处理、核酸提取(可能会导致质量差异,从而导致qPCR靶检测缺乏再现性)、测定设计和优化(可能会导致测定效率和灵敏度差异)、以及数据分析(需要一些主观解释和使用合适的统计方法)等过程中都可能产生差异。至关重要的是,向科学受众提供的信息要包含足够的信息,以便对实验进行严格评估7,但显然情况并非总是如此8。”发表实时定量PCR实验结果的最基本信息(MIQE)指南9解决了这些问题。MIQE指南规定了关于测定的最基本信息,以提高测定的透明度,从而使读者能够评估出版物的技术有效性,并为新的qPCR测定的设计、优化和验证提供指导建议。

MIQE由九个部分组成:实验设计,样品,核酸,逆转录,靶标,引物和探针,测定细节,PCR循环,数据分析。访问我们的MIQE网页下载清单,参见图3.3)。所有参数都与在实验设计、优化和验证过程中应获得的信息有关。当使用商业测定方法或来自已发表文献的测定方法时,仍应加以优化和验证。MIQE有一个清单列出了标有“重要”字样的因素,这些因素都是充分描述qPCR测定必不可少的要素;而标有“理想”字样的内容,则表明该信息是有用的,但即使没有它,也可以复制测定方法,并可评估出版物中的数据。重要的是要认识到,报告PCR效率、分析灵敏度、以及每个个体测定的特异性是必要的,并且应由研究者使用实验室条件加以确定。在进行数字PCR(参见数字PCR)时有一些具体的考虑因素,这些考虑因素都在最近的数字PCR MIQE出版物10中已有规定。


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发表实时定量PCR实验结果的最基本信息


 MIQE指南的清单 美国临床化学家协会的临床化学;美国临床化学协会经P.B.  Hoeber许可,通过版权结算中心以书籍内容形式转载

图3.3. MIQE指南的清单 美国临床化学家协会的临床化学;美国临床化学协会经P.B.  Hoeber许可,通过版权结算中心以书籍内容形式转载。

 


 材料

     


 参考文献

  1. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods 2010; 50: 244-249
  2. PCR Technologies: Current Innovations. 3rd ed. ed Nolan and Bustin CRC Press; 2013
  3. Chen, C., Ridzon, D.A., Broomer, A.J., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 2005; 33: e179
  4. Shi, R., Chiang, V.L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques 2005; 39: 519-525
  5. Tang, F., Hajkova, P., Barton, S.C., et al. MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells. Nucleic Acids Res 2006; 34: e9
  6. Nolan, T., Hands, R.E., Bustin, S.A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc 2006; 1: 1559-1582
  7. Bustin, S.A. Why the need for qPCR publication guidelines?—The case for MIQE. Methods 2010; 50: 217-226
  8. Huggett, J. and Bustin, S.A. Standardisation and reporting for nucleic acid quantification. Accredit Qual Assur 2011; 399-405
  9. Bustin, S.A., Benes, V., Garson, J.A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009; 55: 611-622
  10. Huggett, J.F., Foy, C.A., Benes, V., et al. Guidelines for Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin Chem 2013; 892-902