限制酶

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 引言

通常称为限制酶的限制性内切核酸酶普遍存在于原核生物中。限制性内切核酸酶的功能主要是针对外来遗传物质,特别是针对噬菌体DNA的保护。这些酶的其他功能还包括重组和转座。限制性内切核酸酶构成由内切核酸酶和甲基转移酶活性组成的限制性修饰(R-M)系统。内切核酸酶识别并在特定的识别位点上切割外源DNA。甲基转移酶修饰宿主DNA中的识别位点,并保护其免受内切核酸酶活性的作用。外源DNA中的序列通常不被甲基化,而是经受限制性消化。每种限制酶识别DNA中4-8个核苷酸的特定序列,并在这些位点切割。由具有相同识别位点的不同生物所分离的内切核酸酶被称为同裂酶。


 命名规则

取决于感染病毒DNA,不同的细菌物种合成不同的内切核酸酶。命名限制酶的指导原则基于Smith和Nathans的最初建议1。酶的名称以斜体三字母缩写开头;首字母缩写词的第一个字母表示分离出酶的细菌属的第一个字母,之后的两个字母则代表细菌种群。其后是表示血清型或菌株的其他字母或数字,然后是空格,最后是一个罗马数字,表示发现的年份顺序。例如,从大肠杆菌RY13菌株分离出的第一种内切核酸酶命名为EcoR I。Hind III表示是从流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)血清型d分离出的四种酶中的第三种。


 影响限制酶活性的因素

限制酶的消化活性取决于以下因素:

  • 温度:大多数内切核酸酶在37°C消化靶标DNA,很少有例外。有些工作温度较低(约25°C,Sma 1),而Taq I 工作温度为65°C。
  • 辅因子:限制性内切核酸酶需要某些辅助因子或辅因子组合,以在识别位点消化。所有酶都需要Mg2+作为内切核酸酶活性的辅因子。在具有限制性和甲基化活性的单独蛋白质的R-M系统中,甲基化活性需要S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和ATP。
  • 离子条件:如前所述,所有核酸内切酶都需要Mg2+,但某些酶还需要Na+和K+离子。
  • 缓冲液系列:大多数限制酶在pH 7.0-8.0范围内有活性。Tris-HCl是一种温度依赖性缓冲液,是最常用的缓冲液。
  • DNA的甲基化状态:腺嘌呤或胞苷残基的甲基化会影响DNA的消化。


 限制酶的分类

限制酶基于其活性位点、所需的辅因子和识别序列进行分类。每种限制性内切核酸酶的详细分类和描述见表1。

表1.

限制酶的分类


 限制性消化的产物

DNA链的消化产物可以产生两端为平末端或粘性末端的片段。

EcoR I(货号:R6265)生成的粘性5'末端:



Pst I(货号:R7023)生成的粘性3'末端:




Hae III(货号:R5628)生成的平末端:


 DNA链的甲基化

DNA的甲基化是影响限制性内切核酸酶特异性的主要因素。从表达甲基化酶(如Dam或Dcm)的细菌菌株中分离的DNA可能对内切核酸酶的切割具有抗性,因为识别位点是甲基化的。从表达Dam的大肠杆菌中分离的质粒DNA在GATC位点被甲基化,使其对Mbo I 的切割具有抗性。某些甲基化特异性内切核酸酶也降解被甲基化的DNA而不影响被甲基化的宿主DNA。从解淀粉芽孢杆菌H(货号:R0260)分离的BamH I切割来自表达Dam的大肠杆菌的质粒的甲基化GGATCC位点。从肺炎双球菌分离的Dpn I(货号:R8381)靶向甲基化的T7 DNA


 限制酶的星号活性

星号活性定义为在非理想酶条件下发生的消化特异性的改变。星号活性导致DNA在非特异性位点被切割。导致星号活性的一些非理想条件如下:

  • pH > 8.0
  • 甘油浓度 > 5%
  • 酶浓度 > 100单位/mg DNA
  • 酶的孵育时间延长
  • 反应混合物中存在有机溶剂
  • 辅因子或缓冲液不正确


 限制酶的应用

限制性内切核酸酶广泛用于以下应用的分子生物学研究:

基因工程:限制性内切核酸酶最常见的应用是作为基因工程的工具。内切核酸酶活性使得能够操纵基因组以及在宿主生物体中引入目的序列。这导致宿主产生所需的基因产物。这一概念在生物技术中广泛应用于生产抗生素、抗体、酶和几种二级代谢产物。

DNA作图:使用限制酶的DNA作图(也称为限制性作图)是获得DNA片段结构信息的方法。在这种技术中,用一系列限制酶消化DNA,以产生各种大小的DNA片段。所得片段由琼脂糖凝胶电泳分离,并估算限制酶位点之间的距离。这可用于确定未知DNA片段的结构。

基因测序:使用限制酶消化大的DNA分子,并通过DNA测序仪处理所得的片段以获得核苷酸序列。

限制性内切核酸酶的其他应用包括基因表达和突变研究以及群体多态性的检查。


 Sigma-Aldrich供应的限制酶

表2.

Sigma-Aldrich供应的限制酶及其各自的识别位点
 

货号 限制酶 识别位点
R3131 来自亚麻短杆菌的Bln I 5′-C/CTAGG-3′
R4253 来自嗜热脂肪芽孢杆菌ET的BstE II 5′-G/GTNACC-3′
R2756 来自大肠杆菌的EcoR V 5′-GAT/ATC-3′
R6142 来自乙酸钙不动杆菌的Acc I 5′-GT/(A,C)(G,T)AC-3′
R6885 来自藤黄节杆菌的Alu I 5′-AG/CT-3′
R4258 来自巴氏醋酸杆菌的Apa I 5′-GGGCC/C-3′
R0260 来自解淀粉芽孢杆菌H*的BamH I 5′-G/GATCC-3′
R8631 来自热容芽孢杆菌的Bcl I 5′-T/GATCA-3′
R6377 来自地衣芽孢杆菌的Bgl II 5′-A/GATCT-3′
R3635 来自嗜热脂肪芽孢杆菌NUB 36的Bsm I 5′-GAATGCN/-3′ 3′-CTTAC/GN-5’
R1761 来自蚁酸醋酸梭菌的Cfo I 5′-GCG/C-3′
R7763 来自阔显核菌的Cla I 5′-AT/CGAT-3′
R4256 来自去磺弧菌挪威菌株的Dde I 5′-C/TNAG-3′
R8381 来自肺炎双球菌**的Dpn I 5′-GmA/TC-3′
R4381 来自耐辐射奇球菌的Dra I 5′-TTT/AAA-3′
R3884 来自阴沟肠杆菌590的EclX I 5′-C/GGCCG-3′
R6265 来自大肠杆菌BS5的EcoR I 5′-G/AATTC-3′
R5628 来自埃及嗜血杆菌的Hae III 5′-GG/CC-3′
R1137 来自流感嗜血杆菌的Hind III 5′-A/AGCTT-3′
R8507 来自副流感嗜血杆菌的Hpa I 5′-GTT/AAC-3′
R1258 来自肺炎克雷伯氏菌的Kpn I 5′-GGTAC/C-3′
R4134 来自克吕沃尔菌属的Ksp I 5′-CCGC/GG-3′
R1632 来自易变微球菌Rfl 19的Mva I 5′-CC/(A,T)GG-3′
R8761 来自珊瑚诺卡氏菌的Nco I 5′-C/CATGG-3′
R5509 来自反硝化奈瑟菌的Nde I 5′-CA/TATG-3′
R5634 来自海德堡粘液奈瑟球菌的Nhe I 5′-G/CTAGC-3′
R8506 来自豚鼠耳炎诺卡氏菌属的Not I 5′-GC/GGCCGC-3′
R5884 来自干燥奈瑟球菌的Nsi I 5′-ATGCA/T-3′
R7023 来自斯图普罗威登菌的Pst I 5′-CTGCA/G-3′
R1508 来自普通变形杆菌的Pvu I 5′-CGAT/CG-3′
R2631 来自普通变形杆菌的Pvu II 5′-CAG/CTG-3′
R4756 来自球形红假单胞菌的Rsa I 5′-GT/AC-3′
R5268 来自产色链霉菌的Sac I 5′-GAGCT/C-3′
R0754 来自白色链霉菌G的Sal I 5′-G/TCGAC-3′
R0762 来自金黄色酿脓葡萄球菌的Sau3A I 5′-/GATC-3′
R5007 来自头状链霉菌的Sca I 5′-AGT/ACT-3′
R8256 来自毛缘链霉菌的Sfi I 5′-GGCC(N)4/NGGCC-3′
R4503 来自粘质沙雷氏菌Sb的Sma I 5′-CCC/GGG-3′
R5257 来自球衣菌属的Spe I 5′-A/CTAGT-3′
R7135 来自暗色产色链霉菌的Sph I 5′-GCATG/C-3′
R9507 来自栖热水生菌的Taq I 5′-T/CGA-3′
R7260 来自黄单胞菌属badrii的Xba I 5′-T/CTAGA-3′
R6379 来自黄单胞菌属holcicola的Xho I 5′-C/TCGAG-3′

* 切割甲基化GGATCC位点;** 靶向甲基化T7 DNA

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 参考文献

1. Smith, H.O., and Nathans, D., J, Mol. Biol., 1973 Dec 15; 81(3), 419-23, Letter: A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes.