RNA免疫沉淀(RIP)检测

蛋白质-RNA相互作用在细胞中具有重要作用,包括结构、催化和调节功能。RNA免疫沉淀(RIP)与染色质免疫沉淀(ChIP)相似,可用于检测单个蛋白质与特定核酸的结合,例如mRNA、非编码RNA(如长非编码RNA、增强子RNA、miRNA)和病毒RNA。RIP检测方法主要有两种:天然和交联。天然RIP检测可直接鉴定与目标蛋白质结合的RNA及其在免疫沉淀样品中的丰度。而交联RIP检测可精确定位蛋白质和RNA的直接和间接结合位点(图1)。在交联RIP分析中,使用高反应性甲醛处理活细胞,使得在体内非常接近的分子之间产生蛋白质-RNA可逆性交联(图2)。

图1.天然和交联RIP的比较
尽管天然和交联方法都可以分析染色质相关RNA,但是天然RIP方法(左图)通常可以回收高亲和力的蛋白质-RNA相互作用。相反,交联方法(右图)经过设计可捕获更高分子量的复合物,并且更容易捕获较弱相互作用的RNA。

 

 RNA免疫沉淀方案工作流程

您选择的RIP检测方案部分取决于蛋白质-DNA结合位置(细胞质或细胞核)。常规全细胞裂解物RIP方案可能最适用于细胞质相互作用,而细胞核RIP方案可能最适合发生在细胞核中的相互作用。如果尚无关于RNA结合位置的知识,则建议使用常规全细胞裂解物天然RIP方案(图2A)(17-70017-701),以提高结合RNA的免疫沉淀的可能性,不受结合位置的影响。该方案适用于各种数量和类型的起始材料,例如细胞和组织样品。如果已知结合RNA出现在细胞核中或与染色质相关,则建议使用细胞核天然(17-1052217-10523)或交联RIP(17-1052017-10521)方案。这些方案不是从全细胞裂解物中免疫沉淀RNA,而是对分离的细胞核进行免疫沉淀,从而提高了信噪比。

尽管这些方案适用于所有类型RNA的免疫沉淀,但还有两种其他专门开发的方案可用于鉴定和分析与特定染色质相关长非编码RNA相互作用的染色质区域/RNA纯化染色质分离(ChIRP)(图2B)(17-1049417-10495)或m6A(N6甲基腺苷)RNA甲基化位点的全转录组谱图分析(图2C)(17-10499)。

图2.不同RIP方案的工作流程
A. 全细胞裂解物的天然RIP工作流程(货号:17-700 17-701)B. ChIRP工作流程(货号:17-10494 17-10495) C. m6A RIP 工作流程(货号:17-10499

 

 RIP下游分析

完成RIP方案后分离出的RNA可以通过几种分子检测方法进行分析,包括终点RT-PCR和定量RT-PCR(如果已知RBP的结合靶标)、微阵列或深度测序方法(图3)。根据具有已知序列的RNA靶标,可以设计基因特异性引物,以验证(和定量)免疫沉淀的RNA。确认RIP成功后,可以通过基于群体的方法(如针对所得cDNA的比较微阵列杂交)或通过对RIP的分子适应产物进行深度测序,对免疫沉淀中的RNA群体进行进一步分析。下面介绍了RIP实验的终点或实时定量测量或NGS分析的方法实例。

图3.通过 qRT-PCR 进行 RIP RNAs 分析

.用5 µg正常小鼠IgG或PABPC1抗体和Magna RIP试剂盒(货号:17-700)对HeLa细胞的RIP裂解物(2x107细胞当量/IP)进行免疫沉淀。使用RIP引物ACTB,通过qRT-PCR方法验证了PABPC1相关RNA的成功免疫沉淀。

B.用2.5 μg正常兔IgG或HUR抗体和Imprint RNA免疫沉淀试剂盒(RIP)对HeLa细胞的RIP裂解物(0.5 × 106 或 1.7 × 106 细胞当量/IP)进行免疫沉淀。使用对照引物Actin B和JUN,通过qPCR方法验证了HUR-靶标和非靶标相关RNA的免疫沉淀。

C. 利用qRT-PCR与Magna细胞核交联RIP(货号:17-10520)分析HeLa细胞中与PRC2复合物(EZH2和SUZ12)和U1snRNA(阴性)相关的LincSFPQ。号:17-10520).与竞争品牌试剂盒的信噪比性能进行比较。

图D和E. Magna细胞核RIP检测,分别使用低至5,000(交联,货号:17-10520)和100,000(天然,货号:17-10522)个细胞。灵敏度数据表面,使用5,000个HeLa细胞显示了交联方案NEAT1富集,而使用天然方法则需要100,000个细胞(C)。信噪比数据显示,天然方案的总体阳性与阴性比值更高(D)。

F. 使用来自HEK293细胞的总RNA进行MeRIP(货号:17-10499)分析。然后,使用阳性对照引物(MeRIP引物人EEF1A1阳性,部件号CS220017)和阴性对照引物(MeRIP引物人EEF1A1阴性,部件号CS220018)通过RT-qPCR方法来分析纯化的RNA。

G. 左图:利用MeRIPTMm6A检测法和来自各种细胞的mRNA成功检测甲基化RNA。MeRIP(货:17-10499) ,使用来自无外源性成分的人包皮成纤维细胞(HFF,货号::SCC058)、UM-SCC-104人头颈部鳞癌细胞(货号:SCC072)和人胚胎干细胞(H9)的mRNA。然后,使用阳性对照引物(MeRIP引物人EEF1A1阳性,部件号CS220017)和阴性对照引物(MeRIP引物人EEF1A1阴性,货号CS220018)通过RT-qPCR方法来分析纯化的RNA。中图和右图:分析小鼠和人ES细胞中重编程基因的m6A RNA水平。MeRIP(货号:17-10499)分析,使用来自PluriStem 129/S6 鼠 ES 细胞(货号:SCR012)和H9 人 ES细胞的 mRNA。然后,使用Myc、Sox2、Nanog、Klf4和Oct4的MeRIP m6A 峰引物,通过RT-qPCR方法对纯化的RNA进行分析。小鼠重编程基因的PCR引物序列由Howard Chang(斯坦福大学)提供。人PCR引物是根据已发表的MeRIP-Seq数据设计的。使用Bio-Rad qPCR仪和iTaq ™通用一步法试剂盒(Bio-Rad)进行一步法RT-qPCR。通过利用0.1%输入样品或ΔΔCt方法绘制的标准曲线,计算输入回收率。

H. ChIRP (货号:17-10494) 分析,使用 HeLa 细胞裂解物以及Magna ChIRP TERC lncRNA探针Even组和Odd组(货号:03-309)或NEAT1 lncRNA 探针Even组和Odd组(货号:03-308)或Magna ChIRP 阴性对照探针组(LacZ)(货号:03-307).然后,使用RNA阳性对照引物(TERC或NEAT1)和RNA阴性对照引物(GAPDH),通过qRT-PCR方法对纯化的RNA进行分析。

 

 RNA免疫共沉淀结合高通量测序技术(RIP-seq)

图4.使用Magna细胞核天然RIP试剂盒(货号:17-10522或Magna细胞核交联RIP试剂盒(货号 17-10520)对HeLa细胞的EZH2和SUZ12进行 RIP-Seq 分析。号:17-10520).数据显示,NEAT1(A.上图)和HOTAIR lincRNA转录子(B.中图和下图)处的信号丰富。

 

图5.使用Magna ChIRP 试剂盒(货号:17-10494对DNA下拉进行下一代测序分析。利用HeLa细胞裂解物进行ChIRP。使用生物素化捕获寡核苷酸(Magna ChIRP™ NEAT1 lncRNA 探针组(odd组和even组)(货号:03-308))和阴性对照探针(Magna ChIRP™ 阴性对照探针组(LacZ)货号:03-307) 进行下拉反应。在HiSeq仪器(Illumina)上对序列文库进行测序。使用Bowtie将序列读数与参考基因组(hg19)进行比对。(a) 分别使用来自even

和odd探针组的数据识别峰。MACS等算法可用于此用途。那些共有的峰被认为是有效的峰。(b)使用Howard Chang实验室的分析软件(http://changlab.stanford.edu/protocols.html)进行一系列比对后处理和过滤步骤。数据显示了NEAT1 RNA在NEAT1基因区域和另一个示例区域中的位置(c)。

 

 RIP常见问题解答、故障排除技巧和数据分析指南

在开展RIP实验时,您可能会遇到一些困难,例如无RNA免疫沉淀、背景高或信噪比低。以下信息可帮助您在开始使用此技术前对其有充分的理解;在实验遇到困难时提供故障排除技巧并指导您进行数据分析。

 

 哪款RIP试剂盒适合您?

全细胞裂解物RIP
 

产品名称 货号 亮点
Magna RIP™ RNA结合蛋白质免疫沉淀试剂盒 17-700 1)设计用于检测不同RNA种类之间的相互作用,例如mRNA、miRNA和lncRNA与其结合蛋白的相互作用,主要发生在核糖体、细胞质和细胞核的可溶部分中 2) 484次引用
EZ-Magna RIP™ RNA结合蛋白质免疫沉淀试剂盒 17-701 1) 与17-700的设计相同,增加了对照抗体和引物对照 2) 156次引用
Magna RIP™ Quad RNA结合蛋白质免疫沉淀试剂盒 17-704 17-700的四倍
Imprint® RNA 免疫沉淀试剂盒 RIP-12RXN 1) 包括两种裂解缓冲液:一种较为温和,与RNP结合不紧密;另一种则很苛刻,可与RNP紧密结合。2) 15 次引用
Magna GrIP™ 支架(8孔) 20-400 装有4个钕铁硼磁体的聚乙烯架子,用于ChIP和RIP检测

 

细胞核 RIP (交联和天然)
 

产品名称 货号 亮点
Magna Nuclear RIP™ (交联)细胞核 RNA 结合蛋白质免疫沉淀试剂盒 17-10520 1)从数百万个细胞或低至5,000个细胞中回收各种染色质相关RNA,例如长非编码RNA、增强子RNA和miRNA 2)背景明显较低且信噪比高 3)交联方案可以在体内以较低的亲和力捕获较高分子量的复合物。  
EZ-Magna Nuclear RIP™ (交联)细胞核 RNA 结合蛋白质免疫沉淀试剂盒 17-10521 与17-10520的设计相同,增加了对照抗体和引物
Magna Nuclear RIP™ (天然)细胞核 RNA 结合蛋白质免疫沉淀试剂盒 17-10522 1)从数百万个细胞或低至100,000个细胞中回收各种染色质相关RNA,例如长非编码RNA、增强子RNA和miRNA 2)背景明显较低且信噪比高 3)天然RIP有望回收蛋白质编码RNA结合基序与候选RNA之间的高亲和力、更直接的相互作用。
EZ-Magna Nuclear RIP™ (天然)细胞核 RNA 结合蛋白质免疫沉淀试剂盒 17-10523 与17-10522的设计相同,增加了对照抗体和引物

 

RNA纯化染色质分离(ChIRP)基础试剂盒和不同的 lncRNA 探针组
 

产品名称 货号 亮点
Magna ChIRP RNA Interactome Kit -分离和鉴定非编码RNA:染色质复合物 17-10494 基础 ChIRP 试剂盒,以 lncRNA 和其他类型的染色质相关RNA作为靶标,回收含有非编码RNA的复合物
EZ-Magna ChIRP RNA Interactome Kit -分离和鉴定非编码RNA:染色质复合物 17-10495 与17-10520的设计相同,增加了生物素化TERC lncRNA 阳性对照探针组以及qPCR 和 RT-qPCR 检测引物集
Magna ChIRP™ 阴性对照探针组 03-307 由于哺乳动物细胞通常不含LacZ基因,因此,使用基础Magna ChIRP(货号: S-10-17和17-10495)试剂盒对哺乳动物细胞进行ChIRP实验时,此引物集非常适合用作阴性对照。
Magna ChIRP™ NEAT1 lncRNA 探针组 03-308 包含33个预先设计的20-mer DNA寡核苷酸,它们沿着人lncRNA NEAT1的序列平铺并与之互补,可与基础Magna ChIRP试剂盒(货号:17-10494和17-10495)一起用于ChIRP方法。
Magna ChIRP™ TERC lncRNA 探针组 03-309 包含19个预先设计的20-mer DNA寡核苷酸,它们沿着人lncRNA TERC的序列平铺并与之互补,可与基础Magna ChIRP试剂盒(货号:17-10494和17-10495)一起用于ChIRP方法。
Magna ChIRP 小鼠 XIST lncRNA 探针组 03-311M 包含43个预先设计的20-mer DNA寡核苷酸,它们沿着小鼠XIST lncRNA的序列平铺并与之互补,可与基础Magna ChIRP试剂盒(货号:17-10494和17-10495)一起用于ChIRP方法。
Magna ChIRP 人 HOTAIR lncRNA 探针组 03-312M 包含48个预先设计的20-mer DNA寡核苷酸,它们沿着小鼠XIST lncRNA的序列平铺并与之互补,可与基础Magna ChIRP试剂盒(货号:17-10494和17-10495)一起用于ChIRP方法。
Magna ChIRP U1snRNA 探针 03-313M 包含一个20-mer DNA寡核苷酸,它们沿着人U1小核1的序列平铺并与之互补,可与基础Magna ChIRP试剂盒(货号:17-10494和17-10495)一起用于ChIRP方法。
Magna ChIRP U2snRNA 探针 03-314 包含一个20-mer DNA寡核苷酸,它们沿着人U2小核1的序列平铺并与之互补,可与基础Magna ChIRP试剂盒(货号:17-10494和17-10495)一起用于ChIRP方法。

 

meRIP
 

产品名称 货号 亮点
Magna MeRIP™ m6A 试剂盒- N6-甲基腺苷的全转录组谱图分析 17-10499 1)全面整合经MeRIP验证的试剂,简化MeRIP方法 2)使用高亲和力的m6A单克隆抗体和A/G磁珠实现高信噪比 3)干细胞经过验证 4)6次引用,包括Nature和Cell论文。