DIG标记方法

 通过PCR进行DIG DNA标记

当仅能获得有限量模板时,当模板仅仅部分纯化时,或者当模板非常短时,PCR标记是制备DIG标记探针的优选方法。它比其他方法需要更少的优化,且标记探针产量高。

在PCR标记中,热稳定聚合酶结合DIGdUTP,因为它扩增模板DNA的特定区域。其生成的是高度标记、非常特异、且非常敏感的杂交探针。

通过PCR进行DIG DNA标记

反应原理

在标准PCR反应期间,将地高辛11dUTP掺入新合成的DNA中。聚合酶链反应(PCR)使微量DNA扩增至1 μg以上。唯一的先决条件是需要靶序列的一些序列信息,以便合成合适的引物。

非放射性DIG系列使用地高辛(一种类固醇半抗原)标记DNA、RNA或寡核苷酸以用于杂交,并随后进行染色或发光检测。地高辛通过碱不稳定的酯键与dUTP偶联。标记后的dUTP可以很容易地通过用DNA聚合酶实现的酶促核酸合成加以掺入。非放射性标记与PCR的组合,是用于分析PCR产物以及从少量相应靶序列制备标记探针的有力工具。

有关PCR标记的重要提示

PCR条件

  • 在尝试掺入DIG之前,在不存在DIGdUTP的情况下,根据每个模板和引物组,优化PCR扩增参数(循环条件、模板浓度、引物序列、和引物浓度)。

模板

  • 为获得最佳结果,请使用克隆插入片段作为模板。基因组DNA可能比较难以使用。
  • 模板浓度决定特定探针生成的成功与否。

标记

PCR DIG探针合成试剂盒比大多数标记方法需要更少的优化,因为它包含扩展高保真酶混合物。这种酶混合物:

  • 可以有效地使用GCrich区域作为模板
  • 对于大多数模板,不需要优化MgCl2浓度,也就是说,大多数标记反应都适合1.5 mM MgCl2标准浓度
  • 在“标准”浓度的DIGdUTP(即0.07 mM,也就是5 μl PCR DIG探针合成混合物(小管2)加入到50 μl反应物中)存在下,一些DNA模板(特别是GC含量高或较长的模板)不能有效扩增。对于这些模板,可使用PCR DIG探针合成试剂盒的核苷酸休克溶液(小管4)来改变反应中的DIGdUTP的浓度。

 DIG随机引物DNA标记

随机引物标记可以标记几乎任何长度的模板。

注意:对于非常短的序列,请使用PCR标记方法以获得最佳结果。

这些标记探针特别适用于在基因组南方印迹和重组文库筛选中进行单拷贝基因检测。当然,它们也适用于点/槽印迹和北方印迹。

由于每种引物各有不同的六碱基序列,因此标记探针产物实际上是可变长度的片段的集合。因此,标记探针在凝胶上将显示为一片模糊,而不是独特的条带。标记探针的大小分布取决于原始模板的长度。

DIG随机引物DNA标记

反应原理

在随机引物标记中,Klenow酶在六聚体引物和碱不稳定的DIG-11-dUTP存在下拷贝DNA模板。平均而言,酶在每个20-25个核苷酸的区段中插入一个DIG基团。得到的标记产物是均一标记的敏感的杂交探针(可检测小至0.10-0.03 pg的靶DNA)。

注意:DIG分子的间距非常重要。如果DIG分子彼此比较接近,则空间位阻将阻止大的抗DIG抗体与标记探针结合。

 

 用切口平移混合物对dsDNA进行切口平移标记实现的原位探针

切口平移法最初由Rigby1描述,后来被Langer2用于掺入核苷酸类似物。本文所述的方法是在新合成的DNA的大约每个第20-25位置掺入一个修饰的核苷酸(DIG、生物素、荧光素、或四甲基罗丹明-dUTP)。这个标记密度可以使修饰的核苷酸实现最佳酶促掺入,并产生用于间接(免疫学)检测的最敏感的靶标。对于原位杂交方法,所获得的标记片段的长度应该约为200-500个碱基。

注意:DNA在切口平移标记之前不需要变性。

 用切口平移混合物对dsDNA进行切口平移标记实现的原位探针

反应原理
 

将大肠杆菌聚合酶 I 和DNase I 加入到dsDNA样品中,以启动标准切口平移反应,在此期间,地高辛-11-dUTP被掺入到新合成的DNA中。切口平移法是核酸原位标记的首选方法。
 

参考文献

  1. Rigby, P. W. J.; Dieckmann, M.; Rhodes, C.; Berg, P. (1977) Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J. Mol. Biol. 113, 237–241.
  2. Langer, P. R.; Waldrop, A. A.; Ward, D. C. (1981) Enzymatic synthesis of biotinlabeled polynucleotides: Novel nucleic acid affinity probes.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6633–6637.

 RNA探针的转录标记

对某些应用,DIG标记的RNA是比DIG标记的DNA更有效的杂交探针。例如,DIG标记的RNA探针可以检测纳克量级的总RNA中的稀有mRNA。这些标记RNA探针通过DNA模板的体外转录产生。在RNA转录方法中,DNA被克隆到不同RNA聚合酶(例如T7、SP6或T3 RNA聚合酶)的启动子之间的转录载体的多克隆位点。然后,通过在独特位点(插入片段附近)切割载体使模板线性化。在核糖核苷酸的混合物(含DIG-UTP)存在下,RNA聚合酶把插入的DNA转录成反义RNA拷贝。在反应过程中,DNA可以被转录多次(高达上百倍),以产生大量全长DIG标记的RNA拷贝(在标准反应中,从1 μg DNA可生成10-20 μg RNA)。DIG在大约每隔25-30个核苷酸的位置掺入到RNA中。

RNA探针的转录标记

反应原理

把待转录的DNA模板克隆到合适的转录载体的多接头位点,转录载体含有SP6和/或T3和T7 RNA聚合酶的启动子。当合适的位点线性化之后,在DIG-11-UTP存在下转录RNA。在标准条件下,从1 μg模板约转录10 μg全长DIG标记的RNA。

关于RNA探针标记的重要提示

核糖核酸酶(RNase)

RNase无处不在,不需要任何辅助因子就具备活性。如想取得成功,应采取一切可能的预防措施防止RNase污染。例如:

  • 尽可能使用一次性塑料器皿、烘箱消毒过的玻璃器皿、或者用RNase ZAP或类似试剂消毒过的塑料器皿。
  • 用经过焦碳酸二乙酯(DEPC)或二甲基二碳酸酯(DMDC)处理的水制备所有溶液。如果可能,将溶液高压灭菌。
  • 整个操作过程都佩戴手套。模板纯度
  • 标记效率很大程度上取决于DNA模板的纯度。模板应该高度纯化。
  • 最终模板必须线性化,用苯酚/氯仿萃取,并用乙醇沉淀。

模板序列

  • DNA模板中的某些引物和/或多接头区域与核糖体28s和18s RNA序列部分同源。因此,标记探针可能在含有这些显著RNA的样品中产生特异的、但不需要的信号。为了最大限度地减少这种影响,应尽可能多地从模板中去除多接头序列。
  • 如果使用PCR制作DNA模板,扩展高保真反应的产物中会含有一些具有单个3' A突出端的片段。这种突出端可在转录标记反应中产生被包裹的产物。

模板长度

  • 最佳模板长度约为1 kb
  • 最小长度应至少为200 bp

探针的储存

  • 为保持长期稳定,应将RNA探针等分后储存于-20°C或-70°C下
  • DIG标记的RNA探针在乙醇中保存在-20°C或-70°C下,可至少保持稳定1年。

探针灵敏度

  • 为了快速确定DIG标记的反义RNA探针的灵敏度,需要在体外转录中制备相应的正义RNA(未标记)。然后,用不同浓度的纯化的正义转录物作为北方印迹的靶标。根据印迹结果,即可容易地确定可以用标记探针(反义转录物)检测的最低靶标量(正义转录物)。

 DIG寡核苷酸标记

对某些应用,例如原位杂交,DIG标记的合成寡核苷酸是最佳的杂交探针。除了原位杂交之外,DIG标记的寡核苷酸可用作以下应用中的杂交探针:

  • 点/槽印迹
  • 文库筛选
  • 在南方印迹上检测重复的基因序列
    注意:如果印迹上存在足够的靶DNA(例如10 μg人基因组DNA),则寡核苷酸探针有足够的灵敏度检测复杂基因组中的单拷贝基因序列。
  • 在北方印迹上检测富集mRNA

有几种方法可用于寡核苷酸的DIG标记。这些方法总结如下。

用DIGNHSEster标记5'末端

用DIGNHSEster标记5'末端

所需核苷酸:100 nmol
所需时间和温度:过夜,+15至+25°C

  • 仅需少量模板

用DIGddUTP标记3'末端

用DIGddUTP标记3'末端

所需核苷酸:100 pmol
所需时间和温度:15分钟,+37°C
可以检测:10 pg DNA

  • 仅需少量模板
  • 标记探针无需纯化即可使用
  • 反应规模可无限扩大(但需要将孵育时间延长至1小时)

添加DIGdUTP和dATP的3'尾(约40-50个残基)

添加DIGdUTP和dATP的3'尾

所需核苷酸:100 pmol
所需时间和温度:15分钟,+37°C
可以检测:1 pg DNA

  • 仅需少量模板
  • 产生比末端标记更灵敏的探针
  • 标记探针无需纯化即可使用
  • 反应规模可无限扩大

 用直接检测程序估算探针产量

为了在杂交中添加正确数量的探针,必须首先确定标记反应中产生的DIG标记探针的量。本文给出的直接检测程序把从标记探针制备的DIG标记物进行连续稀释,然后与已知浓度的DIG标记的对照核酸进行比较。

注意:如果是通过PCR标记DNA探针,则无需执行直接检测来估算产量。
对于PCR标记的探针,使用凝胶电泳评估法。

直接检测法包括以下步骤:

  • 制备标记探针的连续稀释液,并在尼龙膜上点样(所需时间:15分钟)
  • 用化学发光法检测点样中的DIG,所需时间为2-2.5小时。

 相关下载

DIG非放射性原位杂交应用手册 - 第4版

DIG是Roche的商标。
仅限用于生命科学研究。不得用于诊断。