样品纯化和质量评估

 引言

纯化DNA和RNA的简单方法的可用性极大地促进了对于基因组和基因表达的分析和表征。需要一种从多种细胞来源中快速方便地分离DNA和RNA的方法,包括来自哺乳动物、植物和细菌培养物的细胞和组织。常规的DNA分离和纯化的方法基于多步骤程序,涉及苯酚/氯仿、阴离子交换或硅胶交换系统。RNA的纯化通常涉及离液盐和苯酚/氯仿,如果需要mRNA,则进一步进行oligo-dT纯化步骤。

PCR或RT反应中的模板材料的质量对于得到的数据的可靠性有深远的影响1。至关重要的是靶材的质量是已确定和被报道的2,并且优先使用可能的最高质量的核酸。考虑到纯度和完整性,本章深入分析了靶材质量对于得到的qPCR和RT-qPCR数据的影响。


 核酸纯化

对于大部分分子生物学的实验来说,核酸的纯化是首要要求。DNA和RNA样品通常通过“粗制”制备。这些纯化方法可能是快速和直接的,当样品被用于PCR/RT-PCR只需要少量的DNA或RNA时尤其适用。一些应用需要通过常规方法纯化的样品;最终的应用将决定所选择的最佳方法。当来自生物材料的核酸需要是完整无损的、纯的、浓缩的且不含下游酶促反应的抑制剂时,提取过程需要添加离液剂。


 离液剂

离液剂是一种通过破坏分子的三维结构从而使得蛋白质、DNA或RNA变性的物质。离液剂妨碍由非共价力介导的分子内相互作用的稳定性,例如氢键、范德华力和疏水作用。常用的离液剂包括尿素(6-8M)、盐酸胍(6M)和高氯酸锂(4.5M)。异硫氰酸胍是一种比盐酸胍更强效的蛋白质变性剂,通常在分离完整的核糖核酸时被用来消除RNase活性。许多RNA分离方案中除了离液剂之外还添加巯基乙醇,以提供还原环境,使得核糖核酸酶A(RNase A)的八个半胱氨酸残基之间形成的四个二硫键变性。离液剂和还原剂如巯基乙醇的组合导致核糖核酸酶展开并完全丧失活性。


 基因组DNA的提取

粗制备

Extract-N-Amp™试剂盒可用来从几乎所有类型样品中快速有效地提取用于PCR的基因组DNA(gDNA),使用简单的单管方案,需要15分钟或更短时间,具体时间取决于样品。Extract-N-Amp试剂盒已被用于从全血、毛囊、小鼠尾巴标记、组织培养细胞、口腔拭子细胞、果蝇、各种植物和种子等样品中提取gDNA。与完全纯化程序不同,该方法避免了机械破坏、有机提取、柱纯化或DNA沉淀。该试剂盒含有用于提取和扩增DNA的试剂,该DNA可用于许多下游应用,包括PCR/qPCR分析。

基因组DNA的纯化

DNA可以从几乎所有细胞或组织来源中分离。纯化gDNA需要在将其从细胞中除去的同时防止降解。分离程序也必须足够温和,以保护DNA长链免受机械应力。首先在缓冲液如磷酸盐缓冲液(PBS)中处理样品,缓冲液中通常含有去垢剂如Triton™ X-100或十二烷基硫酸钠(SDS)用来裂解细胞以及溶解蛋白质和脂质。加入蛋白酶 K,通过蛋白酶消化来分离成簇的细胞和组织,并使酶失活。乙二胺四乙酸(EDTA)是一种螯合剂,可作为溶液中金属离子的清除剂,并添加到DNA纯化缓冲液中以去除镁离子(Mg2+)。Mg2+是DNase的必需辅助因子,因此去除Mg2+会使DNase失活,从而阻止DNA降解。RNase常被用来降解细胞中存在的RNA。

在裂解细胞并降解RNA、蛋白质和脂质后,必须将DNA与这些材料的剩余残余物分离。经典的纯化方法中使用苯酚/氯仿3去除蛋白质,留下DNA和其他水溶性物质。TRI Reagent® 改进了该方法。改用诸如 GenElute™ gDNA纯化试剂盒之类的体系,DNA被吸附到二氧化硅基膜(单柱和96孔板)上,在存在离液盐的情况下,后者会破坏蛋白质结构。当从植物材料中纯化DNA时,必须首先通过在液氮中研磨来机械破坏组织,而全血或细菌则与酶预培养以确保有效的裂解细胞和释放DNA。在DNA与膜结合后进行洗涤,然后通过改变盐浓度进行洗脱,随后用去垢剂和离液剂释放DNA。用沉淀法除去蛋白质、多糖和细胞碎片,随后用过滤柱进行离心。


 总RNA的纯化

细胞RNA的纯化是研究基因表达或受RNA调节的其他细胞功能所必需的。总RNA是从细胞DNA(gDNA和线粒体DNA即mtDNA)转录的RNA,通常是指含有核糖体、转运和信使RNA(rRNA、tRNA和mRNA)并且不包含microRNA(miRNA)或更小的非编码RNA(ncRNA)的样品。总RNA是被分离来进行基因表达分析的目标部分。

RNA的分离是极具挑战的,因为细胞和组织中普遍存在的核糖核酸酶(RNases)会快速降解RNA。因此,在纯化过程中会使用RNase抑制剂。最常用的纯化方法是异硫氰酸胍-苯酚/氯仿萃取。这是TRI Reagent®的原理,它是一种含有苯酚和硫氰酸胍的单相溶液。将组织或细胞样品在TRI Reagent中进行均质化或破碎,将氯仿与裂解物混合,然后通过离心将混合物分成三相。除去含有RNA的水相,用异丙醇沉淀RNA。在细胞裂解后,GenElute RNA分离试剂盒将RNA捕获到硅树脂上。当分离总核和细胞质RNA时,GenElute试剂盒使用硫氰酸胍和2-巯基乙醇使RNase失活。在硫氰酸胍存在时,由于蛋白质二级结构丢失,蛋白质易于溶解,细胞结构瓦解,核蛋白从核酸解离。此外,由于硫氰酸胍比盐酸胍更有效,因此RNase的变性是永久的。将裂解物通过过滤柱旋转以除去细胞碎片并剪切DNA。然后将滤液加到高容量硅胶柱上以结合总RNA,然后用不含RNase的水或缓冲液进行洗涤和洗脱。

在总RNA样品中,主要部分是rRNA(~80%),而mRNA部分仅为2-5%。对于一些程序,可能需要从大量的rRNA和tRNA中纯化mRNA。GenElute mRNA试剂盒提供了一种方便程序,用来从之前制备的总RNA或直接从哺乳动物细胞和组织中分离多聚腺苷酰mRNA。对于直接制备mRNA,可以用SDS /蛋白酶K消化破坏细胞或组织以释放RNA并消除RNase。随后使用与1 μm聚苯乙烯微球共价连接的 Oligo dT30通过杂交法捕获多聚腺苷酰mRNA。聚苯乙烯微球在杂交过程中保持悬浮状态,无需混合或摇动。在微量离心自旋过滤器上洗涤mRNA-微球复合物,然后洗脱纯化的mRNA。

用于纯化“总RNA”的许多提取方法会特异性地选择较大的分子,因此不适合用来分离较小的ncRNA,包括miRNA。有专门设计的用于纯化较小RNA种类的片段的试剂盒,当目标模板为上述RNA时可以选用。


小分子RNA (miRNA) 和非编码RNA(ncRNA)的纯化

由于长度较短,miRNA和其他更小的ncRNA分子的纯化更具挑战性。重要的是选择适当的RNA分离方法来保留小RNA,避免使用总RNA纯化试剂盒,除非厂家明确指出总RNA包括<100个碱基的小RNA。使用特异性柱结合或沉淀,提取RNA分子与任何其他污染因子之间的ncRNA靶差异的方法。RNAzol®是一种酸性硫氰酸胍-苯酚混合物,可破坏细胞和组织,并且,通过加入氯仿或溴氯丙烷,可将所有RNA种类与蛋白质和DNA分离。随后的纯化方法允许单独制备小RNA、mRNA或总RNA样品,使得可以在下游应用中平行分析所有这些片段。miRPremier® microRNA分离试剂盒是基于硅胶的结合-洗涤-洗脱试剂盒,专为回收小RNA而设计。miRPremier试剂盒使用盐析法在小RNA与柱结合之前去除较大的分子,因为将小RNA与硅(二氧化硅)结合所需的乙醇量也会使蛋白质和其他大分子沉淀,形成粘性悬浮液,从而阻塞柱并阻止RNA的有效回收。避免该问题的另一种方法是使用预清除步骤去除大分子,例如使用RNAzol或预结合柱进行提取,从而可以加入足够的乙醇来结合小RNA而不堵塞RNA结合柱。


 核酸样品质量评估

样品处理和核酸提取的程序是可变的,因此定义一个可靠方案用于分析样品质量和数量并且在出版物中详述该分析的细节是至关重要的2。RNA的数量很大程度上取决于rRNA的产率,而RNA的质量取决于RNA分子的纯度(无抑制剂)和完整性。然而,在测定样品质量时,纯度和完整性会影响结果;对于低浓度样品,难以确定其纯度和完整性,同时杂质的存在会干扰定量。有许多技术可用于评估核酸数量和质量,但其中没有一种能够单独提供充分描述样品所需的全部信息。因此,重要的是要考虑一系列选项,以确保样品质量不会影响最终的分析数据1

核酸定量

紫外光谱

通常使用分光光度计测量UV吸光度来对核酸进行定量。在260nm和280nm处读取稀释的DNA或RNA样品的吸光度。基于比尔-朗伯定律,以260nm处的光密度(OD)来确定溶液中的RNA或DNA浓度,该定律预测了吸光度和浓度之间的线性相关性。

比尔-朗伯定律

    A = εbc
    A = 吸光度
    b = 比色皿的路径长度,以cm为单位(通常为1cm)
    c = 分析物浓度
    ε = 消光系数

对于RNA, ε = 40 μg/mL
对于DNA, ε = 50 μg/mL

当260nm处的OD值(A260)读数为1.0时,相当于约40 μg/mL的纯RNA和50 μg/mL的纯双链DNA。然而,比尔-朗伯定律仅当OD读数在2以内有效,并且所述OD /浓度关系取决于样品的纯度。显然,污染物质在260nm或280nm处的吸收将影响估计的OD读数。纯RNA的A260/A280为2.1,而纯DNA的A260/A280为1.8。
 

表7.1. 污染物对 A260/A280比值的影响

 

  预期A260/A280 比值
双链DNA 1.7-1.9
RNA 1.8-2.0
  pH值对比值的影响
DEPC水 (pH 5-6) 1.6
无核酸酶水 (pH 6-7) 1.85
TE (pH 8) 2.14
  污染物对比值的影响
苯酚污染 ↓ 比值
高蛋白污染 ↓ 比值
异硫氰酸胍污染 ↓ 比值

如果在280nm和230nm测量样品的吸光度(分别为A280和A230),也可以确定潜在的污染物如蛋白质、离液盐和苯酚的OD值。这样, A260/A280和 A260/A230的比值可以用作样品纯度的指标。但是,应该注意的是,这种方法对DNA中蛋白质污染的测定非常不敏感4

此外,缓冲液的pH值和离子强度也会干扰OD读数。研究发现,当使用不同来源的水进行分光光度测定时,A260/A280的比值存在显著差异。例如,当用来悬浮RNA的水的pH值从pH5.4变化到7.5-8.5时,RNA的A260/A280比值显著增加,大约从1.5到2.05

重要的是的A260/A280比值和A260/A230比值都接近2.0(表7.1)。
 

TRIS、乙醇和异丙醇污染 

TRIS污染的影响:TRIS污染不会显著影响RNA/DNA的吸收光谱。

乙醇污染的影响:当在TE pH8.0中测量时,乙醇污染不会显著影响RNA/DNA的吸收光谱。但是,当在纯水中进行测量时,A260/A280的比值会下降,因此,比值低于2.0表示可能存在乙醇污染。

异丙醇污染的影响:当在TE pH8.0中测量时,异丙醇污染不会显著影响RNA/DNA的吸收光谱。但是,当在纯水中进行测量时,A260/A280的比值会下降,因此,低于2.0的比值表示可能存在异丙醇污染。
 

蛋白质、异硫氰酸胍和苯酚污染

蛋白质污染的影响:含有0.01%BSA污染的样品可以显示几乎正常的吸收光谱,尽管A260/A280的比值可能低于1.9(RNA)或1.7(DNA)以警示有些东西污染了样品。在含有0.5%BSA时,吸光度光谱显示异常,这清楚地表明样品中存在显著水平的污染。因此,可以通过异常的A260/A280比值检测到高浓度的蛋白质,但是低和中等浓度则不能。

异硫氰酸胍污染的影响:异硫氰酸胍对A260/A280比值的影响很小,因此,它对RNA定量的影响也很小。但是,异硫氰酸胍的存在对 A260/A230比值有非常大的影响;在含有0.5%污染物时,A260/A230比值降低到0.5以下。应避免使用含有可疑胍污染的样品,因为这会对下游的酶促反应产生有害影响。

苯酚污染的影响:苯酚对RNA定量具有非常大的影响。当50ng/μL的RNA样品含有0.5%苯酚污染的情况下,测得的浓度超过三倍。苯酚对RNA定量的强烈干扰作用是归结于270nm处的污染吸收峰。在RNA浓度非常低,低于10ng/μL时,这种污染峰通常会与RNA混淆。然而,RNA吸光度总是在260nm处,从不在270nm处,因此如果吸收峰在270nm处,则是由于污染引起的。在使用苯酚法分离出RNA后,错误地高估RNA浓度是一个严重的问题。当RNA浓度较低时尤其如此。
 

自动紫外分光光度法

虽然传统的紫外分光光度法要求使用相对大量的样品进行测量,但现在有一些系统,如NanoDrop® 2000紫外-可见分光光度计,它们是自动化的且可以支持极小样品量的高精度分析。样品保留系统消除了对比色皿和毛细管的需求,这使得用于分析的样品量减少到0.5μL和2μL之间。NanoDrop提供从约200nm到350nm的吸光度扫描,这是确定RNA/DNA浓度和纯度的相关区域。
 

基于荧光的核酸定量系统

使用荧光染料来定量核酸是吸光度分光光度法的替代方法6,7。使用荧光方法测定核酸浓度是利用小分子或染料与核酸的结合,并测量随后荧光特征的变化。虽然该方法比吸光度分光光度法更昂贵,荧光法定量对目标核酸更灵敏、更精确并且可能具有特异性。

由于荧光计以相对而非绝对单位测量荧光值,因此首先用已知浓度的标准核酸溶液进行校准,且该标准核酸溶液具有与待测样品相似的特征。在校准之后,单次测量可以确定溶液中核酸的浓度,但是通常需要一条标准曲线来确定测量范围是在线性范围内。

QuBit® 2.0荧光计(Life Technologies)等自动化系统可用于一系列不同的基于荧光的定量分析,用来测量溶液中的核酸浓度。该测定显示出较宽的动态检测范围,并且能够准确分析小样品。

至关重要的是认识到OD读数是吸收的量度,不能用作样品质量的完整评估。类似地,基于荧光的系统提供数量而非质量的量度。因此,它们不能用来测试样品的完整性,还必须进行合适的分析,例如毛细管电泳、凝胶分辨或 3’/5'比值检测(如下所述)。


 凝胶电泳和毛细管核酸质量分析系统

凝胶电泳

RNA虽然在热力学上是稳定的,但在几乎普遍存在的RNase酶存在下会迅速消化。结果是在样品中常常出现较短的RNA片段,这可能会影响下游应用的结果。RNA的降解过程还不完全清楚,并且依赖于目前存在的RNase的类型。此外,从某一特定提取物中提取的RNA的质量可能有很大差异,需要持续监测。因此,确定RNA样品的完整性很重要。

为了评估潜在的降解,已经应用了电泳方法来根据所包含分子的大小分离样品。历史上,RNA的完整性已经通过用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳来进行评估,其产生一个明确的条带模式。在变性琼脂糖凝胶上运行的总RNA显示两个不同的核糖体片段,分别对应于真核RNA的18S或28S、原核RNA的16S和23S以及较小RNA种类的附加片段。传统上,这些rRNA条带在变性琼脂糖凝胶上的强度被用来计算一个比值以表示RNA完整性。当真核样品的28S:18S条带强度的比值约为2.0时,RNA被认为具有高质量。

图7.1显示了一个通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳评估总RNA的实例。对于高质量的总RNA,两个最大的rRNA在大约5kb和2kb处显示为离散条带,并且较上的条带强度应该是较下的条带强度的约两倍。mRNA主要在两个rRNA条带之间,可能以轻微弥散的形式出现,也可能几乎不明显。

琼脂糖凝胶分析评估RNA完整性

图7.1. 琼脂糖凝胶分析评估RNA完整性。将总RNA样品(2μg)在TBE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭染色。泳道1和2显示高质量的RNA,而泳道3和4显示降解的RNA。

然而,凝胶电泳是一种不敏感的检测样品完整性的方法,需要大量的样品。当处理小样品时,很少有足够的量进行凝胶电泳并且还可以进行所有期望的实验。由于这种方法依赖于人类对凝胶图像的解释,因此它是主观的,难以进行实验室之间的比较,并且得到的数据难以进行数字化处理。

通过自动毛细管电泳分析总RNA可以解决其中一些问题。
 

毛细管核酸质量分析系统

核酸样品可以使用Agilent 2100 BioAnalyzer或者Bio-Rad Experion等设备来分析和比较。利用这些系统,电泳轨迹被用来指定数字完整性值或完整性类别。

这些仪器采用芯片实验室方法,将毛细管电泳与荧光检测相结合。基于已经小型化的传统凝胶电泳原理,在芯片上进行电泳过程,减少了样品消耗和分离时间。

该芯片包含可容纳样品、凝胶和外标(按片段大小排列)的孔。在制造过程中,微通道以玻璃制造,以在孔之间形成互连网络。然后用筛分聚合物和荧光染料填充这些微通道。将电极插入孔中,芯片成为集成电路。

带电的生物分子如DNA或RNA会在电压梯度的驱动下通过基质。由于恒定的质荷比和筛分聚合物基质的存在,较小的片段比较大的片段迁移得更快,使得分子根据大小分开。

染料分子插入核酸链,这些复合物通过激光诱导荧光进行检测。然后将数据转换成电子类凝胶图像和电泳图。

Agilent 2100 BioAnalyzer通常结合RNA 6000 Nano和RNA 6000 Pico LabChip试剂盒一起使用。该生物分析装置基于微流体芯片、凝胶填充通道中的电压诱导尺寸分离和小型规模的激光诱导荧光(LIF)检测的结合。可以顺序处理12个样品,同时每个样品的消耗量很少。RNA分子用嵌入染料染色并通过LIF进行检测。数据自动存档,可以电泳图、类凝胶状图像和表格格式提供。

BioAnalyzer具有良好的线性动态范围,同时RNA 6000 Nano测定可用于分析浓度范围从25 ng/μL至500 ng/μL的RNA样品。虽然RNA 6000 Nano测定的定量下限为25 ng/μL,但建议使用至少50 ng/μL进行有意义的RNA完整性系数(RIN)计算。当浓度较低时,观察到的RIN样品间差异更大。Pico测定法可用于测定浓度范围为50pg/μL至5ng/μL的样品的RNA完整性。

Agilent 2100 BioAnalyzer软件可用来评估在rRNA峰之前、之间和之后检测到的RNA比例,以确定RNA样品的相对完整性系数(RIN)。完整RNA的RIN为10,而完全降解的RNA的RIN为1。这种方式便于解释电泳图,并使得样品间的比较成为可能。

部分降解的RNA(RIN <9)可以在RT-qPCR中产生令人满意的结果,但这可能取决于所分析的靶点、所需的灵敏度和RT策略。相较于利用基因特异引物使用一步法的RT-qPCR策略,另一种两步法RT-qPCR策略是利用oligo-dT来启动逆转录且PCR引物位于cDNA长链的5'末端附近,后者需要的样品具有更高的完整性。详细讨论了不同RT策略的效果及其对降解模板的耐受性(参见逆转录)。此外,检测稀有而非丰富的mRNA靶点,需要更高的样品完整性。因此,还应考虑模板降解对不同丰度的靶点比例(例如,测试和参考基因)的影响。应在每一项检测中根据经验确定RIN和RT-qPCR成功之间的相关性。尽管RIN极大地促进了RNA制备完整性的评估,并且使得对样品或RNA分离程序的比较更加容易,但是还不能预先确定RNA是否适合于指定的实验。图7.2显示了两种RNA样品的Agilent BioAnalyzer曲线。使用基因特异引物,用一步法RT-qPCR产生的cDNA中几种罕见mRNA靶点的产量未见差异。然而,当使用两步法RT-qPCR,以oligo-dT来启动RT,在2个循环后检测到相同的mRNA靶点,表明较低完整性样品(11,RIN = 7.0)中的mRNA比较高质量样品(9,RIN = 9.8)中低4倍。
 

电泳图显示使用Agilent 2100 BioAnalyzer评估RNA完整性

图7.2. 电泳图显示使用Agilent 2100 BioAnalyzer评估RNA完整性。将总RNA制备样品(~150ng)在RNA 6000 Nanochip上分级并使用Agilent 2100进行分离。评估完整性并归结于RIN。

样品的质量至关重要,因此必须在样品用于qPCR分析之前进行检验。已经清楚地证明,对降解的RNA样品的分析可能导致数据质量较差1,尽管情况并非总是如此8,并且部分取决于RT方案(参见逆转录9

虽然毛细管系统比传统的凝胶电泳有很大的进步,但它们是专用的设备,价格昂贵且不适用高通量。此外,已经发现RIN可能并非所期望的万能量度。图7.3显示的样品在裸露的人体皮肤上培养了1分钟,当使用Agilent BioAnalyzer分析总RNA时,出乎意料地显示没有降解。使用另一种方法来测定降解,可以看到它们含有降解的转录本,需要(见下文)。


通过毛细管电泳分离总RNA的电泳图

 

图7.3. 使用Agilent 2100 BioAnalyzer通过毛细管电泳分离总RNA的电泳图(~150 ng)。在分析之前,该RNA已在裸露的人手上培养了1分钟。得到的RIN为10表明RNA显然是高质量和完整的。

 

因此,重要的是谨慎应用RIN的解读和其他自动生成的样本完整性测量,并考虑进行额外的特异性转录本的研究。其中一种方法基于使用两种独立的方法来测量靶点。完整性测定基于测量位于相同转录本的5'和3'的靶点的数量的比值(图7.410。这提供了关于特异性转录本RNA完整性的相对测量(对于3'/5'检测方案,参见附录A)。


图表显示3'/5'完整性测定

图7.4. 图表显示3'/5'完整性测定。使用oligodT启动RT从总RNA产生cDNA。设计两个靶点为相同转录本的qPCR测定,并且用不同的荧光团标记探针,以方便进行多重检测。如果RNA是完整的,则5'和3'检测的检出应该相等,而如果RNA降解,则相对于5'检测,3'检测的检出将更高。.
 

这样,3'/5'比值检测可用于评估RNA样品的质量。图7.5显示了这种方法的用途,即测试图7.3中显示的RNA样品中GAPDH转录本的状态(检测中的特定靶点应在任何指定的实验中进行测试)。在oligo-dT启动cDNA合成后,使用5'和3'检测来定量GAPDH转录本。如果RNA是完整的,则预期每个检测得到的浓度相同(比值=1),而如果RNA被降解,则相对于5'检测,3'检测预期有更高的拷贝数。

图7.5. 用3'/ 5’检测鉴定降解的RNA样品的演示。尽管Agilent 2100 BioAnalyzer分析得到这两种RNA样品的RIN均为10,但3'/5'检测证明在人手上进行1分钟培养(1'降解)后,样品的5'检测有9个Cq(约1,000倍)损失,而3'保持不变。 
 

使用Agilent 2100 BioAnalyzer对RNA进行分析,发现与降解前相同的纯化样品相比,在裸露的人手上培养1'后,两个RNA样品的RIN均为10,因而可以得出结论,图7.3中显示的RNA是完整的。当应用3'/5'检测时,3'检测显示两个样品有相同的Cq,而5'检测则显示有9个循环的损失,表明GAPDH 5'损失1,000倍并且转录本降解。该观察结果证明rRNA的状态(RIN算法的重要组成部分)不是mRNA完整性的可靠指标。然而,作为总体样品质量量度的3'/5'检测的可靠性取决于单个转录本降解的速率11。为了验证这一点,通过在室温下培养72小时,或者在62°C下培养2小时,对从HT29细胞中提取的RNA进行降解。使用Agilent 2100 BioAnalyzer分析所有样品质量。同时对13个普遍表达的基因的3'和5'区域进行了检测,并且对于每个基因,均使用两种检测法在纯化的高质量未降解的RNA样品(HT29)中测定这些靶点的量(图7.6A)。

检测来测定RNA的质量

图7.6A.使用3'/5'检测来测定RNA的质量 a)使用oligo-dT逆转录来自HT29细胞的RIN约为10的RNA样品,并确定13个基因(X轴)中每一个的3'/5'比值(y轴)。当两种检测都用于相同的靶点并且RNA是高质量时,定量存在一般的3'偏差。基因之间的偏差程度不同,从而影响基因之间比值的确定,例如当归一化参照基因时。(数据来自英国Stephen Bustin教授)
 

使用oligo-dT对来自HT29细胞的RIN约为7的RNA样品进行逆转录


图7.6B.使用oligo-dT对来自HT29细胞的RIN约为7的RNA样品进行逆转录,并确定13个基因(X轴)中的每一个的3'/5'比值(y轴)。当两种监狱用于同一靶点且RNA质量高且与图7.6A中显示的比值有明显的3'位移时,定量存在强烈的3'偏差。基因之间的位移程度显著不同,表明不同的基因以不同的速率降解。(数据来自英国Stephen Bustin教授)

使用oligo-dT对来自HT29细胞的RIN约为5的RNA样品进行逆转录

图7.6C.使用oligo-dT对来自HT29细胞的RIN约为5的RNA样品进行逆转录,并确定13个基因(X轴)中的每一个的3'/5'比值(y轴)。复制的数据范围非常广泛。(数据来自英国Stephen Bustin教授)

当使用高质量的RNA时,复制的数据非常接近,但很明显,对于许多基因而言,测定的偏差高达10倍,通常对于UBC,3'处具有更显著的100倍偏差。这可能反映了由于模板折叠或其他RT-PCR影响因子导致的降解或检测差异。一些靶点似乎在检测中显示5'偏差,这可能是由于RT-qPCR检测的效率差异或其他组分导致的。然后使用来自RIN为7.3和5.3的RNA的cDNA(分别为图7.6B7.6C),应用该检测来定量相同的靶点。当使用中度降解的RNA样品(RIN 7)时,有明显的降解迹象,大多数基因显示出10至1,000倍的3'位移,表明这些转录本在3'和5'检测之间发生降解。有趣的是,有三个基因显示出5'位移,这可能是由于降解导致构象变化使得RT或5'qPCR更有效。由于每个基因的变化不同,很明显使用RIN 为9的 RNA进行测量的基因之间的比值与使用RIN为 7的 RNA进行测量的基因之间的比值有着显著不同。当使用RIN为5的RNA时,变异程度更高,每个基因的3'/5'比值平均为1左右。由于高质量的完整RNA也可以预期平均3'/5'= 1,因此发现该系统适用于中等至明显无降解的RNA样品的完整性测定,是除了凝胶或毛细管电泳外的一种改进。

在测定中观察到5'偏差是有趣的。理论上,对于相同效率的检测,不可能产生比3'扩增子更多的5'扩增子。显然,其他因素正在影响这些检测的差异性能。关于样品质量的进一步考虑是污染物的存在,这可能抑制甚至增强RT或qPCR性能,并且它们是否可能是基因靶点特异性的。


 污染

在PCR检测中,重要的污染形式是样品中不适当存在的核酸模板,该模板也可能与特定靶点一起被检出,会导致假阳性,或者产生可以抑制下游反应的物质,导致假阴性或较低的模板浓度估值。

模板污染

因为PCR过程中会以指数方式产生扩增子的拷贝,从而使得PCR检测特别容易受到特异性目标靶序列的扩增子污染。因此,进行PCR检测的过程产生了未来PCR检测的理想污染物。在分子生物学实验室中,将建立和运行反应的空间从PCR后分析区域中分离出来是十分重要的,后者将对PCR产物进行分析和进一步操作。在可能的情况下,最好使用带有专用设备和实验室涂层的单独房间,使得PCR后分析空间就不会与干净的(PCR前)空间接触。许多实验室还对人员进入这些区域进行了进一步的控制,以防止反应继续进行下去。定量PCR检测尤其容易受到扩增子污染,因为它们能够检出单个模板分子,污染模板会干扰数量的测量。

除了产生特定扩增子的PCR之外,在实验室设置中需要小心以确保原始模板材料不从一个样品转移到另一个样品(交叉污染),或者,在分析人类样品的情况下,该材料不是从进行分析的人员那里引入的。

强烈建议采用标准实验程序和适当的控制措施以识别潜在的污染源。

gDNA对RNA的污染

在分析RNA时,重要的是要确保没有gDNA污染。建议用溶液中的DNase I对样品进行酶处理以去除污染的gDNA,这对于研究无内含子基因,或者当检测设计不能区分gDNA和cDNA序列时,尤其重要。在可能的情况下,建议在内含子/外显子边界上设计检测方法,使得仅有经处理的mRNA序列可以被扩增和/或检测。这并不总能阻止gDNA扩增,因为存在经过处理的假基因序列,它们是有效的基因组cDNA序列(参见PCR / qPCR / dPCR测定设计)。同样值得考虑的是,DNA存在于试剂中并且可能引起污染问题12


 抑制作用

抑制剂的存在对不同靶点的qPCR检测有不同的影响13。因此,样品中抑制剂的存在可导致真实数据的复杂扰动。由于每个检测受到的影响是不同的,因此目的基因(GOI)和参考基因数量之间的比值可能不能反映每个基因的真实丰度,导致对相对靶点数量的不正确估计或在解释基因分型检测方面的困难。

在实验过程中通常引入的PCR抑制剂包括:tris、乙醇、异丙醇,EDTA、逆转录酶、异硫氰酸胍和苯酚。

一种可用于检测抑制剂的系统是SPUD检测14图7.7)。使用这种方法,人工扩增子(来自与任何其他已知序列缺乏同源性的马铃薯核酸序列)在水(扩增对照;图7.7样品a)或测试样品(图7.7样品b和c)存在下进行qPCR。如果测试样品不含SPUD检测的抑制剂,则扩增对照和测试样品的量化周期(Cq)将是相同的。但是,如果测试样品含有抑制剂,则Cq将增加(关于测试的详细方案参见SPUD实验方案附录A)。


SPUD检测的示例。在这种情况下,样品c和对照样品a之间的Cq 差异表明存在抑制剂。

图7.7. SPUD检测的示例。在这种情况下,样品c和对照样品a之间的Cq 差异表明存在抑制剂。


 一个完整实例:RNA样品质量分析

前面描述的每种样品质量控制方法都用于确定样品的特定特征。本节包含可应用于示例的工作流程的描述,以及对每个质量控制测试提供的数据的描述。提出的调查既不详尽,也不作为最终的标准操作程序;它仅作为可能的质量控制程序的一个例子。

五个RNA样品被制备并且按顺序标记为A至E。使用NanoDrop分析这些样品,并且发现它们具有非常相似的浓度(约100ng/μL)。对于每个样品,A260/A280比值使用两个独立的读数记录两次(图7.8),并且发现在所有情况下约为1.9,表明在A280nm处检测到高质量且无污染的样品,值得注意的是该分析中不存在 A230nm读数。使用毛细管电泳(Agilent 2100 BioAnalyzer)进行的分析得到了不同的图像(图7.9)。样品A和B的质量高(RIN10,浓度110ng/μL,与NanoDrop读数一致),样品C高度降解(RIN 2.4,浓度62ng/μL,为NanoDrop浓度测定的一半),样品D和E是高质量的(RIN分别为 9.1和9.5),但浓度低于样品A和B(分别为30 ng/μL和43 ng/μL)。因为NanoDrop不会反映降解情况,因此两种测量方法得到的信息在某种程度上是互补的。然而,也存在冲突,因为样品D和E的浓度显著不同。这将引起关注,并应引发进一步的调查。虽然毛细管电泳是一种强大的样品评估工具,但它的通量相对较低,并非适用于所有研究。关于样品完整性的另一种测试方法是3'/5'分析。将该测试应用于样品A-E,根据NanoDrop读数,使用相同浓度。当使用这种方法测试这些样品时,很明显样品A(图7.10A)和B(数据未显示,与样品A相同)的RNA是完整的,而样品C的RNA是高度降解的(图7.10B)。需要注意,对于样品C,5'和3'检测的Cq 显著偏移到更高的值,表明相对于样品A和B的特定靶点的损失。样品D和E的曲线不符合预期(图7.10C显示样品D,样品E数据未显示但是与前者相似),因为5'检测具有比3'更低的Cq ,表明在由oligo-dT启动产生的cDNA样品中5'信号比3'更多。另一种解释是这些样品含有一种抑制剂,对3'检测的影响比5'更大。为了测试该理论,对所有样品进行SPUD检测(图7.11)。样品A至C中没有抑制剂的证据,但样品D和E均显示SPUD检测的抑制,且样品D导致检测完全失败。

根据上述所有信息,可以得出结论,每个样品中存在相等浓度的核酸材料(NanoDrop),并且样品含有未检出的污染物,这些污染物在在280nm(蛋白质)处被吸收(未测试其他波长)。 样品A和B具有高完整性且没有检测到抑制剂,样品C高度降解(毛细管电泳和3'/5'检测)且没有检出抑制剂,样品D和E完整但含有PCR抑制剂(3'/5'和SPUD)。
 

NanoDrop质量评估

图7.8. NanoDrop质量评估 (A260/A280)

RNA样品A-E的Agilent 2100 BioAnalyzer分析

图7.9. RNA样品A-E的Agilent 2100 BioAnalyzer分析
 

RNA样品的GAPDH 3’/5’多重测定

图7.10A.RNA样品的GAPDH 3’/5’多重测定  

 

样品C的GAPDH 3’/5’多重测定

 

图7.10B. 样品C的GAPDH 3’/5’多重测定

样品C的GAPDH 3’/5’多重测定

图7.10C. 样品D的GAPDH 3’/5’多重测定

样品D的GAPDH 3’/5’多重测定

图 7.11. 样品A–E的SPUD分析  


 材料

     

 参考文献

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