PAGE简介 — 基于大小的蛋白质分离

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聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺与双丙烯酰胺(N,N'-亚甲基双丙烯酰胺)的反应形成,产生高度交联的凝胶基质。凝胶充当筛子,蛋白质在电场作用下通过这个筛子。蛋白质总体带正电或负电,这使得蛋白质分子能够朝向等电点移动,在等电点分子没有净电荷。通过使蛋白质变性并赋予它们均匀的负电荷,可以在它们向正电极迁移时基于它们的大小分离它们。

 

蛋白质样品和色同步蛋白标记物的SDS-PAGE

 

图1:蛋白质样品和色同步蛋白标记物的SDS-PAGE(C1992


 实验方案

所需材料和试剂

  • 带电源的垂直电泳室、玻璃板、垫片和点样梳
  • 丙烯酰胺 / 双丙烯酰胺溶液(A3449A3574A3699
    或者使用以下试剂制备30%丙烯酰胺溶液:

  • 凝胶浇铸缓冲液:对于不连续凝胶,制备分离胶和积层胶所需的缓冲液是不同的。

    • 1.5M Tris-HCl,pH8.8(制备分离胶):将18.15 g Tris碱溶于80 mL蒸馏水中。用6N HCl调节pH至8.8。用蒸馏水将最终体积补足至100 mL。

    • 0.5 M Tris-HCl,pH 6.8(制备积层胶):将6 g Tris碱溶于80 mL蒸馏水中。用6N HCl调节pH至6.8。用蒸馏水将最终体积补足至100 mL。

  • 2X Laemmli上样缓冲液:

  • 10X运行缓冲液GE28-9902-52;作为阳极和阴极缓冲液)
    或者用以下试剂制备1X运行缓冲液:

  • 10% SDSL3771
  • 10% 过硫酸铵A3678
  • TEMEDT9281

注意:丙烯酰胺和双丙烯酰胺在性质上具有神经毒性。所有步骤均应佩戴无粉手套进行。

制备凝胶

  • 用去离子水和乙醇清洁凝胶浇注装置的玻璃板和垫片。
  • 将玻璃板和垫片组装在稳定、平整的表面上。
  • 根据所需凝胶的百分比,使用以下体积制备分离凝胶溶液(制成体积为10 mL)。
凝胶% 水 (mL) 30% 丙烯酰胺 (mL) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (mL) 10% SDS (µL) 10% APS (µL) TEMED*(µL)
8% 4.6 2.6 2.6 100 100 10
10% 3.8 3.4 2.6 100 100 10
12% 3.2 4.0 2.6 100 100 10
15% 2.2 5.0 2.6 100 100 10

* TEMED必须最后添加。

  • 将凝胶溶液倒入组装了垫片的玻璃板中。为了使分离凝胶表面保持均匀和水平,用水或异丙醇(I9516)间隔表面。
  • 在室温下使凝胶凝固约20-30分钟。
  • 使用以下体积制备积层凝胶溶液(制成体积为10 mL):
凝胶% 水 (mL) 30% 丙烯酰胺 (mL) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (mL) 10% SDS (µL) 10% APS (µL) TEMED*(µL)
5% 5.86 1.34 2.6 100 100 10

* TEMED必须最后添加。

  • 丢弃分离胶上的水。
  • 加入5%积层胶溶液直至溢出。立即插入点样梳,确保凝胶中或梳齿周围没有气泡。
  • 在室温下使凝胶凝固约20-30分钟。

样品制备

  • 在一定体积的蛋白质样品(细胞或组织裂解液)中,加入等体积的上样缓冲液。
  • 将上述混合物在95°C下煮沸5分钟,16000G离心5分钟。
  • 这些样品可以在-20°C下储存,也可以用于进行凝胶电泳。


 凝胶染色

考马斯蓝染色:用考马斯亮蓝R-250染色蛋白质凝胶是显示通过SDS-PAGE分离的蛋白质的常用方法。它非常灵敏,适合长期储存凝胶。

所需试剂

操作步骤

  • 电泳后,将凝胶放入含有凝胶固定溶液的塑料托盘中。将托盘放在摇床上固定蛋白质2小时。
  • 丢弃凝胶固定溶液,然后加入考马斯溶液。放在摇床上,将凝胶染色2-4小时。
  • 染色步骤后,用蒸馏水洗涤凝胶数次,以去除多余的染料。
  • 将脱色溶液添加到凝胶。放在摇床上脱色约4个小时,直到可以看到清晰背景上的清晰蓝色条纹。
  • 脱色后,可将凝胶储存在凝胶储存溶液中,并根据需要拍照。


 银染

Sigma-Aldrich提供适用于SDS-PAGE凝胶的高灵敏度蛋白质检测银染试剂盒。还需要以下试剂:

操作步骤

  • 电泳后,将凝胶浸入固定溶液40分钟。在固定溶液中浸泡过夜能产生更清晰的背景。
  • 丢弃固定溶液,用30%乙醇溶液洗涤凝胶10分钟,然后用超纯水洗涤10分钟。
  • 倒出水,并将凝胶在敏化剂溶液中孵育10分钟。
  • 丢弃敏化剂溶液,用水洗涤凝胶两次,每次洗涤持续10分钟。
  • 倒出水,并将凝胶浸泡在银溶液中10分钟。
  • 倒掉银溶液,并在水中洗涤凝胶1.5分钟。
  • 倒掉水,将凝胶浸入显影液中3至7分钟。
  • 向显影液中加入5 mL终止液,孵育5分钟。丢弃显影液/终止液,在超纯水中洗涤凝胶15分钟。
  • 这时凝胶可以拍照,也可以储存在新鲜的超纯水中。

双重染色:使用CBB R-250对凝胶进行染色,然后使用上述步骤进行银染色。

荧光染色:Sigma-Aldrich为蛋白质电泳提供荧光SYPRO和Lucy染色剂。可以在黑暗中将凝胶浸入荧光染色剂中,或者在电泳过程中将凝胶与阴极缓冲液混合。

 

产品编号 名称
S4942 SYPRO® 宝石红蛋白质凝胶染色剂
S5692 SYPRO® 橙色蛋白质凝胶染色剂
68721 LUCY® 506溶液
43772 LUCY® 565溶液
41629 LUCY® 569溶液
51723 LUCY® 565分子量标准试剂盒
51153 LUCY® 起始试剂盒

染色实验方案取决于所使用的染色剂,可以在此处找到:


 可逆凝胶染色

可逆凝胶染色使用户能够在SDS-PAGE后进行蛋白质的西方蛋白印迹。

R-PROB染色:R-PROB是一种独特的染色剂,可用来检测PAGE凝胶和西方蛋白质印迹上的蛋白质。

所需试剂

操作步骤

  • 将电泳后的凝胶浸入固定溶液中20分钟。重复此步骤两次。
  • 在水中冲洗凝胶两次,每次冲洗持续30分钟。
  • 将凝胶在染色溶液中孵育20-40分钟,同时轻轻搅拌。
  • 用10%醋酸洗去多余的染色剂。
  • 脱色:用EDTA洗涤凝胶,然后在水中或固定溶液中洗涤15分钟,洗两次。

铜染色:为了确认蛋白质的迁移和分离,凝胶可以用可逆染色剂(如CuCl2)染色。 


所需试剂

  • 0.3 M CuCl2 溶液
  • 0.25 M Tris和0.25 M EDTA溶液

操作步骤

  • 将电泳后的凝胶用蒸馏水冲洗最多30分钟。
  • 将凝胶浸入0.3 M CuCl2溶液中10分钟。
  • 用去离子水冲洗。
  • 蛋白质可以在蓝色背景上显示为清晰的区域。
  • 脱色:反复在0.25 M Tris和0.25 M EDTA溶液(pH 9)中洗涤染色的凝胶。
  • 在进行后续的转印操作之前,将脱色后的凝胶转移至转印缓冲液中。

 

Sigma-Aldrich印迹和垂直电泳系统

图2:Sigma-Aldrich印迹和垂直电泳系统

 

如果需要在电泳后将蛋白质转印到膜上,在此处可以找到实验方案。


 参考文献

  • Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press, 1989.