北方和南方印迹实验方案及简介

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 简介:什么是北方和南方印迹?

核酸与蛋白质等大分子向固相支撑膜的转移称为印迹。通过凝胶电泳分离的DNA和RNA分子的片段分别在称为南方和北方印迹的过程中转移到尼龙或硝酸纤维素膜上。南方印迹由Edwin Southern于1975年推出,是一种检测DNA样品中特定DNA序列的方法。基于该方法出现的其他印迹技术被称为北方印迹(用于RNA)、西方印迹(用于蛋白质)、东方印迹(用于翻译后蛋白质修饰)和东南印迹(用于DNA-蛋白质相互作用)。

南方和北方印迹实验方案包括以下主要步骤:

  • 纯化DNA / RNA:从细胞或组织来源中提取和纯化DNA / RNA。
  • 消化DNA:用限制酶把DNA消化成片段。RNA不需要该步骤。
  • 凝胶电泳:在琼脂糖凝胶上分离DNA片段。RNA样品可以在琼脂糖凝胶上用甲醛分离,甲醛作为限制RNA分子二级结构的变性剂。
  • 转膜:将DNA / RNA片段从凝胶转移到尼龙膜上。
  • 预杂交(封闭):用含有鲑鱼精子DNA的预杂交溶液清洗尼龙膜,以封闭非特异性DNA相互作用并降低背景噪音。亦可使用PerfectHyb™ Plus缓冲液,这种情况下不需要用鲑鱼精子DNA进行封闭。
  • 探针的制备:准备新的探针DNA并用32P α标记的dCTP标记。
  • 杂交:用标记的探针孵育印迹。
  • 探针的检测:在-80°C下曝光胶片,检测探针和目标DNA / RNA序列。

DNA / RNA印迹操作程序中的步骤

图1:DNA / RNA印迹操作程序中的步骤


 南方印迹实验方案


 所需材料
  • 用于DNA分离和纯化的试剂
  • 用于限制性消化DNA的试剂
  • 琼脂糖凝胶电泳的试剂和缓冲液
  • 琼脂糖凝胶电泳仪
  • Whatman滤纸
  • 纸巾
  • 带正电荷的尼龙膜
  • 鲑鱼精子DNA
  • 杂交管
  • X光胶片

 所需缓冲液
  • 10X TBE(93290),用于凝胶电泳。对于较大的DNA片段,可以使用TAE缓冲液(65497)代替TBE。或者使用Bionic™缓冲液(B6185)代替TAE或TBE,以在更短的时间内获得更清晰的条带。您可以使用以下试剂制备10X TBE缓冲液:

    TRIS 1.3 M
    硼酸 450 mM
    EDTA 25 mM

  • 20X SSPE(S2015),用作预杂交和转膜缓冲液。在类似的印迹实验方案中,可以使用20X SSC(93017)代替SSPE。或者您可以使用以下试剂制备20X SSPE溶液:

    NaCl 2.98 M
    EDTA 0.02 M
    磷酸盐缓冲液(pH 7.4)0.2M

  • 变性溶液(N1531),用于使dsDNA变性,以使其与探针结合。或者您可以使用以下试剂制备1X变性溶液:
    NaCl 1.5 M
    NaOH(S5881)0.5 N
    将pH调节至~13

  • 中和溶液(N6019),用于在变性dsDNA后中和凝胶。或者您可以使用以下试剂制备1X中和溶液:

    NaCl 1.5 M
    TRIS HCl 1M
    将pH调节至7.5

  • Denhardt溶液(D2532),在预杂交过程中用于封闭非特异性DNA杂交。或者您可以使用以下试剂制备50X Denhardt溶液:

    牛血清白蛋白(A7906)1%
    聚蔗糖(F2637)1%

    聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)1%

    将组分溶解在水中至最终体积为50mL。过滤除菌。

  • * 2X预杂交溶液(P1415),用于准备探针杂交所用的膜。或者您可以使用以下试剂制备1X预杂交溶液(100 mL):

    20X SSPE 30 mL
    100X Denhardt溶液10 mL
    10% SDS 10mL
    水50 mL

  • * 杂交溶液(H7140),用于杂交步骤。或者您可以使用以下试剂制备杂交溶液(100 mL):

    20X SSPE 30 mL

    10% SDS 10mL
    水60 mL

  • 1X探针缓冲液,用于探针混合物。(100μL;新鲜制备):

    1 M TRIS,pH 7.6 50μL
    2 M MgCl2 5μL
    0.5 M DTT 10 μL
    水35 μL

  • 1X探针混合物(27 μL):

    探针缓冲液 2.7 μL
    寡核苷酸探针(0.2 μg/μL)2μL
    T4磷酸核苷酸激酶(PNK)1 μL
    水11.3 μL
    32P-ATP 10 μL

  • 6X低苛性洗涤溶液,用于去除低同源性杂交并降低背景噪音。使用以下试剂制备600 mL洗涤溶液:

    20X SSPE 180 mL
    10% SDS 12 mL
    水408 mL

  • 1X高苛性洗涤溶液,用于去除紧密同源杂交,并进一步降低背景噪音。使用以下试剂制备600 mL洗涤溶液:

    20X SSPE 30 mL
    10% SDS 12 mL
    水558 mL

* PerfectHyb™ Plus杂交缓冲液(H7033)可用来代替Denhardt、预杂交和杂交溶液。PerfectHyb™ 缓冲液经过优化,可在短至1-2小时的杂交中产生最大信号,且背景最小。PerfectHyb™ Plus配方适用于使用任何类型的探针、以及在任何类型的膜(带正电或中性尼龙和硝酸纤维素)上进行的任何杂交实验方案。有关更多信息,请参见PerfectHyb™ 缓冲液实验方案


 DNA分离

Sigma-Aldrich提供GenElute™试剂盒,用于从植物和真菌(E5038)、哺乳动物细胞或组织(G1N70G1N10G1N350)、以及血液(NA2010NA2020)中分离DNA。可以在此处找到使用GenElute™试剂盒进行DNA分离的详细实验方案。

此外,DNAstable® 试剂盒(93000-001-1EA93021-001-1EA53091-016-2ML93121-017-1EA)可用于运输DNA或在室温下储存和稳定DNA。


 限制性消化

用适当的限制酶在37℃下消化DNA样品2-24小时。如果DNA样品是克隆衍生产物,则1-2小时的消化时间就足够了。对于基因组DNA,通常需要用过量的酶(5-10X)孵育过夜。

如有必要,使用乙醇沉淀法浓缩消化的DNA。在凝胶上分离之前,必须完全除去痕量乙醇。


 凝胶电泳

在琼脂糖凝胶上溶解消化的DNA。TAE应该用于较短的运行(<4小时)和较大的DNA片段,而TBE应该用于较长的运行(> 4小时)和较小的DNA片段(<1kb)。或者使用Bionic™ 缓冲液B6185)在比TAE或TBE更短的时间内获得更清晰的条带分辨率(有关更多信息,请参见Bionic™ 缓冲液数据)。用溴化乙锭染色凝胶,并使用UV透照仪获得凝胶图像。如果在电泳之前将溴化乙锭掺入琼脂糖中,则可以在运行后立即获得凝胶图像。


 转膜

在转膜步骤中,来自电泳凝胶的DNA(或RNA)将被转移到尼龙膜上,以使探针易于杂交和检测。

  • 将凝胶转移到含有变性溶液的托盘中,溶液要足以完全覆盖凝胶。用这种溶液洗涤凝胶两次,每次洗涤在摇床上持续25分钟。
  • 用水冲洗凝胶两次。
  • 用中和溶液洗涤凝胶两次,每次洗涤在摇床上持续15分钟。
  • 用水冲洗凝胶两次。
  • 用20X SSPE在摇床上洗涤凝胶30分钟。
  • 在上述步骤中,准备用于转膜步骤的Whatman纸和膜。
  • 切下一条尼龙膜(15356),将其浸泡在水中。切下一条比凝胶宽的Whatman纸,将其浸泡在10X SSPE缓冲液(转膜缓冲液)中。
  • 切下三条几乎与凝胶大小相同的Whatman纸。
  • 切下数张几乎与凝胶大小相同的纸巾。
  • 在含有10X SSPE的托盘上放置一个稳定的平台。
  • 在平台上放一张saran保鲜膜。在saran保鲜膜上,放一张浸有10X SSPE的Whatman纸。用玻璃棒在它们上面滚动,以把气泡撵出。确保Whatman纸的边缘接触托盘中的SSPE缓冲液。这张Whatman纸将充当芯子,将SSPE缓冲液向上吸并穿过凝胶,以在尼龙膜上沉淀DNA条带。
  • 将凝胶面朝下放在湿润的Whatman纸上。将膜放在凝胶上面。用玻璃棒在它们上面滚动,以把气泡撵出。
  • 在膜上放置三层Whatman纸。用玻璃棒在它们上面滚动,以把气泡撵出。
  • 在这上面放一叠纸巾,然后放上重物(如玻璃板)。
  • 让这个组装静置过夜,以完全转移DNA片段。将不超过15kb的DNA片段转移大约需时18小时。
  • 转移完成后,将印迹放入自动设置的UV交联机中。进行UV交联以使DNA或RNA与尼龙膜共价键合,这在检测期间增强杂交信号。另一个选择是在转膜后烘干膜,这使核酸与膜之间形成非共价的半永久键合。DNA不能与硝酸纤维素膜进行UV交联,只能烘烤。

南方 / 北方印迹转膜组件

图2:南方 / 北方印迹转膜组件


 预杂交(封闭)

预杂交(也称为封闭)步骤的作用是最大限度地减少探针对尼龙膜的非特异性附着。鲑鱼精子DNA通常用作封闭剂,用来防止探针粘附到膜上,确保它只与已经转移到膜上的目标DNA条带相互作用。按如下步骤制备预杂交溶液或使用PerfectHyb™ Plus缓冲液(H7033):

  • 将预杂交溶液加热至42°C。
  • 将鲑鱼精子DNA样本(D9156)加热至95°C 5分钟,然后立即在冰上冷却。
  • 将鲑鱼精子DNA添加到温热的预杂交溶液中,使DNA的最终浓度为50 μg/mL。
  • 从UV交联机中取出印迹,并小心地将其卷入杂交管中。
  • 将含有精子DNA的预杂交溶液加入杂交管中,并将其置于42℃的杂交炉中5小时。
 杂交

DNA的互补链(探针)用于检测应存在于膜上的目标序列。来自两种不同来源的DNA组合形成“杂合”dsDNA,但前提是这两条链是同源的。

  • 制备1X探针混合物,在37°C水浴中孵育40分钟。
  • 让探针混合物通过G-25 Sephadex柱,以去除游离标记(未掺入的探针)。
  • 用液体闪烁法确定探针的特异活性。
  • 将10 mL杂交溶液加热至49°C,向其中加入10-15 X 106 cpm的探针,并充分混合。
  • 将印迹中的预杂交溶液丢弃;在标记的探针中添加杂交溶液。49°C孵育过夜。
    说明:或者使用PerfectHyb™ Plus缓冲液(H7033)以更短的时间杂交,产生的信号更强。如想了解更多实验方案和数据,请参见PerfectHyb™ Plus实验方案
  • 将6X洗涤溶液加热至49°C。将印迹中的杂交溶液丢弃,添加6X洗涤溶液。
  • 将6X低苛性洗涤溶液加热至49oC。将印迹中的杂交溶液丢弃,添加6X洗涤溶液。低苛性洗涤去除低同源性杂交,以留下高同源性杂交,从而精炼目标DNA样品。
  • 制备1X高苛性洗涤溶液,并将其加热至49oC。将印迹洗涤约30秒并丢弃洗涤溶液。该步骤使用高苛性溶液去除紧密同源的杂交,以进一步精炼目标DNA。
  • 使用盖革计数器检查印迹的活性。如果每秒有10-50条具有照射峰值的条带,就是理想的结果。如果背景太高,则用1X洗涤溶液再次清洗印迹。
 检测探针
  • 将印迹放入衬有新的saran保鲜膜的暗盒中,小心地将印迹包好,确保印迹和保鲜膜之间没有气泡。
  • 将暗盒放入暗室,将X光胶片放在印迹上。锁上暗盒,将其置于-80°C过夜。在第二天显影。
  • 可将另一张X光片放在印迹上,并放回-80°C进行另一次曝光。

 北方印迹实验方案

北方印迹实验方案类似于南方印迹实验方案, 只是RNA序列是在掺入甲醛的变性琼脂糖凝胶上分离。


 RNA分离
  • 用TRI Reagent®T9424)或用于哺乳动物细胞或组织的GenElute™试剂盒(RTN70RTN10RTN350)从细胞或组织样本中分离RNA。
  • 如要确定RNA的质量和浓度,请读取样品在260 nm和280 nm处的吸光度。吸光度比率A260 / A280为1.8-2.1表明RNA质量良好。
 凝胶电泳
  • 用移液器将样品小心地装入孔中。如果需要,也可以加载含有各种大小的RNA片段的合适标记(R7020R7644)。
  • 关于在琼脂糖凝胶电泳中使RNA变性的详细实验方案,请参见核酸电泳简介

如果在电泳之前将溴化乙锭掺入琼脂糖中,则可以在运行后立即获得凝胶图像。


 转膜

转膜设置、预杂交、杂交和检测的实验方案与南方印迹相同。


 材料

     

 参考文献

  • Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press, 1989.