使用Cas9-GFP CRISPR质粒进行细胞工程的技巧

1. CRISPR设计和特异性

CRISPR核酸内切酶的活性差异很大,即使是在接近基因组的多个 CRISPR中也是如此。1为此,我们强烈建议您测试3到4CRISPR靶向不同DNA序列的核酸酶。由于CRISPR系统的DNA靶位点的大小明显小于CompoZr®ZFNs (例如 30-36 bp)所需的大小,因此在设计过程中必须小心谨慎,以确保将基因组中其他地方的脱靶断裂降至最低。最近的证据表明, CRISPR核酸内切酶的脱靶是一个值得关注的问题,一些机构正在研发避免脱靶活性的指导操作 5, 8。此外,用于CRISPR设计的许多在线工具也都可用,然而,我们已将特定ZFN设计中的核心功能应用于CRISPR/Cas系统,以在 计算机上创建全基因组CRISPR靶序列的集合。请查看我们的在线CRISPR产品系列为ZFN、CRISPR及相关供体DNA提供最新CRISPR设计套件和定制设计服务。


 2. 用于细胞培养应用的CRISPR质粒的递送

注:除非通过自定义请求指定,否则我们的CRISPR质粒产品将以小规模制备等分试样的形式递送,可能不适合转染到特定的细胞类型中。为了获得最佳结果,我们建议在转染前使用不含内毒素的DNA纯化试剂盒大规模制备质粒。

ZFN项目的先前经验表明,核转染是一种适用于多种细胞类型的可靠传递方法。对于在人类细胞中进行的初步实验,我们建议将最规模制备的CRISPR质粒DNA核转染入经过良好验证的细胞类型,如K562或U2OS,以评估双链断裂活性或供体整合水平。这些细胞系已被证明具有高水平的同源重组反应2 ,使其成为检测ZFN和CRISPR核酸酶与新设计的供体构建体相容性的理想选择,然后才转向更具挑战性或未知的细胞类型。对于小鼠和大鼠细胞培养测试,neuro2A和C6适用于初始CRISPR实验的细胞类型。剂量实验的一个很好的起点是每0.5 ~ 100万个细胞中含有2-8 μg的CRISPR质粒。

由于我们的单一载体格式包含一个由GFP连接的Cas9表达盒,在进行基因分型检测或单细胞克隆工作之前,可随后通过显微镜或FACS检测转染的细胞以监测转染效率(图1)。

 通过显微镜或FACS监测Cas9-GFP表达盒活性。

图1 通过显微镜或FACS监测Cas9-GFP表达盒活性。


 3. 监测CRISPR双链断裂活性

目前已有数种用于监测双链断裂(DSB)活性的公开方案。最快速、灵活和经济的检测方法是错配切割检测,它可以检测真核细胞中NHEJ活性产生的插入和缺失(位点)的多样性。最常见的方案使用CEL-I酶(又名:Surveyor核酸酶)6 和T7核酸内切酶I(T7EI)。7如果您的机构有足够的生物信息学和深度测序资源,深度测序也可用于检测和定量CRISPR处理的细胞群中的插入和缺失活性。

如果尽管使用了许多常用CRISPR设计进行尝试但仍无法检测到DSB活性,请考虑为Cas9-GFP表达丰富细胞群,如下一节所述。


 4. 单细胞克隆和基因分型

由于该产品中的质粒实现了GFP连接的Cas9表达盒,荧光激活细胞分选(FACS)可用于分离Cas9诱导修饰频率显著增加的细胞群(见图2)。这种FACS富集方法在递送效率和/或Cas9表达水平低或检测不到的情况下特别有用。此外,GFP共表达方法比替代性报告载体更有优势,包括:

a) Cas9-GFP连接的表达不需要额外的步骤将人工靶位点克隆到替代报告质粒中。

b)转染的dsDNA总量减少。在许多情况下,某些细胞类型对高剂量的dsDNA敏感,将替代报告质粒形式的额外dsDNA质量添加到现有的CRISPR和供体载体构建体中可导致细胞毒性。

c)通过实施Cas9-GFP mRNA、体外转录gRNA和单链寡核苷酸 (ssODNs),选择使用“不含 dsDNA”的方法。


Cas9和GFP蛋白编码区通过编码2A肽的小序列连接。2A肽是一种“自切割”肽,允许从一个转录中产生两个单独的蛋白质,并利用“核糖体跳跃”而不是蛋白水解切割机制产生两个单独的蛋白质。3, 14

可根据常用方案收集细胞用于FACS。我们建议将细胞分为低、中、高GFP表达水平的组分。GFP表达最高的细胞群已被证明可以富集基因组编辑,“高”群体的范围为总细胞群的1%至30%。“高”和“中”群体的最佳大小可能会有所不同,这取决于基因组位点、细胞类型、递送方法和其他实验变量。建议将细胞群分成低、中、高三个部分,每个部分占总细胞群的1~20%。

使用靶向人体KRAS基因座的单一Cas9-GFP载体,通过FACS在人体K562细胞中富集有CRISPR/Cas诱导的CEL-I活性。

图2使用靶向人体KRAS基因座的单一Cas9-GFP载体,通过FACS在人体K562细胞中富集有CRISPR/Cas诱导的CEL-I活性。


 5. 质粒图谱和特征

质粒图谱和特征

在该载体中实现的Cas9蛋白包含能够产生双链断裂的HNH和RuvC活性。Cas9与Evrogen的TagGFP2荧光蛋白相连。TagGFP2是TagGFP的改良变体,TagGFP 是  Aequorea macrodactyla类似于GFP蛋白的突变体。15, 17TagGFP2 具有明亮的绿色荧光,激发/发射最大值分别为483和506 nm。2A-GFP编码序列的侧翼是两个HpaI限制性位点,允许去除或替换2A-GFP元素。XbaI位点可用于线性化载体,以便利用T7 RNA聚合酶通过体外转录产生Cas9-GFP mRNA。

 


 材料

     


 参考文献

 

  1. Cong, L., et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339(6121):819-23.
  2. DeKelver. et al., Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc fingernuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. GenomeRes. 2010 Aug;20(8):1133-42.
  3. Donnelly, M. L., et al., The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’ sequences. J Gen Virol 2001, 82, 1027–1041.
  4. Friedland, A. E., et al, Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. 2013 Jun 30. doi: 10.1038/nmeth.2532.
  5. Fu, Y., et al., High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013.  doi: 10.1038/nbt.2623. PubMed PMID: 23792628.
  6. Guschin, D. Y., et al., A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 2010;649:247-56.
  7. Huang, M. C., et al., A simple, high sensitivity mutation screening using Ampligase mediated T7 endonuclease I and Surveyor nuclease with microfluidic capillary electrophoresis. Electrophoresis. 2012 Mar;33(5):788-96.
  8. Hsu, P. D., et al., DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013.  doi: 10.1038/nbt.2647. PubMed PMID: 23873081.
  9. Hwang, W.Y., et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 2013; 31(3): 227-9.
  10. Jinek. M., et al., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337(6096): 816-21.
  11. Jinek, M., et al., RNA-programmed genome editing in human cells. Elife 2013; 2:e00471. doi: 10.7554/eLife.00471.
  12. Mali, P., et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013; 339(6121):823-6.
  13. Mäkinen, P. I., et al., Stable RNA interference: comparison of U6 and H1 promoters in endothelial cells and in mouse brain. J Gene Med. 2006; 8(4):433-41.
  14. Ryan, M. D., et al., Cleavage of foot-and-mouth diseasevirus polyprotein is mediated by residues located within a 19 amino acid sequence. J Gen Virol 1991, 72(Pt 11): 2727–2732.