胰蛋白酶

 物理特性和体内处理

胰蛋白酶
酶学委员会(EC)编号:3.4.21.4
分子量:23.3 kDa1,2(牛和猪)
消光系数:E1%= 12.9-15.4(280nm)3,4
pI:10.1 - 10.52,5(牛)

胰蛋白酶原
分子量:24 kDa5(牛)
消光系数:E1%= 14.4(280 nm)
pI:9.32(牛)

胰蛋白酶原是胰腺的腺泡外分泌细胞中产生的胰蛋白酶的酶前体(酶原)形式。人胰腺分泌三种同种型。阳离子和阴离子形式是主要的人类同种型。抑制剂耐受型脑胰蛋白酶原仅以微量存在。 酶原仅在到达小肠内腔后才被激活。肠激酶通过从NH2末端水解六肽(对于牛胰蛋白酶在Lys6-Ile7肽键处)将胰蛋白酶原激活成胰蛋白酶。牛胰蛋白酶原由229个氨基酸的多肽单链组成,并通过六个二硫键交联。胰蛋白酶可以自催化激活更多胰蛋白酶原成为胰蛋白酶。胰蛋白酶由223个氨基酸残基的多肽单链组成。这种天然形式的胰蛋白酶被称为β-胰蛋白酶。β-胰蛋白酶(其在牛序列中的Lys131-Ser132处被切割)的自溶产生α-胰蛋白酶,其通过二硫键连接在一起。胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶S1家族的成员。胰蛋白酶的活性位点氨基酸残基包括His46和Ser1832-5

胰蛋白酶

 特异性、动力学、底物和测定方法

特异性和动力学

胰蛋白酶以赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的C末端侧切割肽。如果酸性残基位于切割位点的任一侧,则水解速率较慢,而如果脯氨酸残基位于切割位点的羧基侧,则不发生切割。

胰蛋白酶将水解几种合成底物的酯和酰胺键:2,7,8
 

产品编号 品名 添加到购物车
B7260 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐
B4500 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐
B0885 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸4-甲氧基-β-萘基酰胺盐酸盐
B4750 Nα-苯甲酰基-DL-精氨酸β-萘基酰胺盐酸盐
B3133 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐 ≥99%(TLC),适用于胰蛋白酶底物
B4875 Nα-苯甲酰基-DL-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐 ≥98%

其他底物

胰蛋白酶的最适pH为7-9。10

测定方法11
大多数Sigma制剂的活性通过连续速率分光光度测定法测定并以BAEE单位表示。

单位定义:使用BAEE作为底物,一个BAEE单位在25℃、pH 7.6下每分钟产生0.001的ΔA253。反应体积 = 3.2 mL(1 cm光程)。

BAEE作为底物

 条件

温度 = 25 ℃,pH = 7.6,A253 nm,光程 = 1 cm
在3.2 ml反应混合物中,最终浓度为63 mM磷酸钠,0.23 mM Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯,0.06 mM盐酸,和100单位胰蛋白酶

试剂

  1. 67 mM磷酸钠缓冲液,pH 7.6,25 °C(在去离子水中,使用一元无水磷酸钠Sigma产品编号:S0751制备100 ml。在25 ℃下用1 M NaOH调节至pH 7.6。)
  2. 0.25 mM Na-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯溶液(BAEE)(在试剂A中,使用Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐Sigma产品编号:B4500制备50ml)。
  3. 1 mM盐酸溶液(HCl)(在去离子水中,使用浓盐酸Sigma产品编号:
     258148制备50 ml)。
  4. 胰蛋白酶溶液(在使用前,立即在冷的试剂C中制备每ml胰蛋白酶含有500 BAEE单位的溶液)

操作步骤

移取(以毫升计)以下试剂到合适的石英比色皿中:
 

  测试 空白
试剂B(BAEE) 3.00 3.00


平衡至25 ℃。使用适当恒温的分光光度计监测A253nm直至恒定。然后添加:
 

  测试 空白
试剂C(HCl) 0.20
试剂D(酶溶液) 0.20


立即通过倒置混合,并记录A253nm的增加约5分钟。使用测试、空白溶液的最大线性速率获得ΔA253nm/分钟。
 

计算

BAEE单位/ml酶 =

          ΔA253nm/min试样 - ΔA253nm/min空白样)(df)
____________________________________
(0.001) (0.20)

df = 稀释因子
0.001 = 在pH 7.6、25 ℃下,3.2 ml反应混合物中每单位胰蛋白酶的变化,其单位为A253nm/分钟
0.20 = 所使用的酶的体积(以毫升为单位)
 

单位/mg固体 =

         单位/ml酶
__________
mg固体/ml酶

 

说明

  1. 该测定操作程序不能用于测定固定化胰蛋白酶。
  2. 有关USP/NF操作程序,请参阅USP专论。
  3. 此操作程序仅供参考。有关Sigma质量控制程序的最新版本,请联系我们的技术服务部。

单位换算

1 BAEE µM 单位 = 200 BAEE 单位
1 TAME µM 单位 = 0.27 BAEE µM 单位
1 BAEE µM 单位 = 3.64 TAME 单位
1 TAME µM 单位 = 55 BAEE A253 单位
1 BAEE A253 单位 = 0.018 TAME µM 单位
1 TAME µM 单位 = 180 TAME A247 单位
1 TAME A247 单位 = 0.33 BAEE 单位
1 USP 单位 = 3.0 BAEE 单位
1 NF 单位 = 1.1 USP 单位
 

 抑制剂

抑制胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂包括:2,11
 

产品编号 品名 添加到购物车
A6664 4-脒苯基甲磺酰氟盐酸盐
A8456 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐 ~97%
A6191 微生物来源的抗痛素二盐酸盐
A2221 来自人血浆的抗凝血酶III冻干粉,≥95%(SDS-PAGE)
A9141 来自牛血浆的抗凝血酶III冻干粉,200-400单位/mg蛋白(E1% / 280 = 6.5)
A6150 来自人血浆的α1-抗胰蛋白酶无盐冻干粉
A9024 来自人血浆的α1-抗胰蛋白酶无盐冻干粉
A1153 来自牛肺的抑肽酶冻干粉,3-8 TIU/mg固体
B3906 来自水蛭的Bdellin冻干粉,> 0.1 IU/mg蛋白(E280)
B6506 一水盐酸苯甲脒 ≥98%
D0879 二异丙基氟磷酸盐
D7910 3,4-二氯异香豆素
G2417 甲磺酸加贝酯固体
L2023 亮肽素三氟醋酸盐 ≥90%(HPLC),微生物
M6159 来自人血浆的α2-巨球蛋白冻干粉,≥98%(SDS-PAGE)
P7626 苯甲基磺酰氟 ≥98.5%(GC)
T7254 Nα-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐 ≥96%(TLC),粉末
T0256 来自牛胰腺的胰蛋白酶抑制剂I-P型基本无盐冻干粉
T2011 来自鸡蛋清的胰蛋白酶抑制剂III-O型(不含卵抑制剂)
T4385 来自火鸡蛋清的胰蛋白酶抑制剂III-O型(不含卵抑制剂)
T9003 来自黄豆(Glycine Max)的胰蛋白酶抑制剂I-S型冻干粉
T9008 来自黄豆(Glycine max)的胰蛋白酶抑制剂的1%水溶液(不含缓冲液)
T9253 来自鸡蛋清的胰蛋白酶抑制剂II-O型,部分纯化的卵类粘蛋白,含有卵抑制剂
T9378 来自利马豆(Phaseolus limensis)的胰蛋白酶抑制剂II-L


 重组和溶液的稳定性

等分并在-20℃下储存时,胰蛋白酶在1 mM HCl(pH 3)溶液中可稳定保存约1年。Ca2+(20 mM)的存在也会减缓胰蛋白酶自身消化(自溶)的能力,保持胰蛋白酶在溶液中的稳定性。2,9 胰蛋白酶在2.0 M尿素、2.0 M盐酸胍或0.1%(w/v)SDS中保留大部分活性。13 胰蛋白酶在高pH(11以上)时发生可逆的变性,在TCA或高浓度尿素(大于6.5 M)存在下生成沉淀。3 为了消除所有胰蛋白酶活性,需要在1%(w/v)SDS中,在100℃下保持5分钟。14

胰蛋白酶原溶液在酸性缓冲液(pH2-4)中是稳定的,而在中性缓冲液中,则会发生胰蛋白酶的自催化活化。
 

 应用和实验方案

细胞解离
线粒体分离
蛋白质测序

 产品

用于一般研究应用的胰蛋白酶

牛胰蛋白酶
 

产品编号 品名 添加到购物车
T1426 来自牛胰腺的胰蛋白酶基本无盐冻干粉,≥10,000 BAEE单位/mg蛋白质
T8003 来自牛胰腺的胰蛋白酶I型,~10,000 BAEE单位/mg蛋白质
T1005 来自牛胰腺的胰蛋白酶XI型冻干粉,≥6,000 BAEE单位/mg蛋白质
T8658 来自牛胰腺的胰蛋白酶的冻干粉,适用于蛋白质测序
T7309 来自牛胰腺的胰蛋白酶,≥2,500USP单位/固体,符合USP测试规范
T9935 来自牛胰腺的胰蛋白酶基本无盐冻干粉,9,000-13,000 BAEE单位/mg蛋白质,经细胞培养测试
T8802 来自牛胰腺的胰蛋白酶基本无盐冻干粉,10,000-15,000 BAEE单位/mg蛋白质
T6424 来自人胰腺的胰蛋白酶无盐冻干粉,每小瓶≥1,000 BAEE单位

猪胰蛋白酶
 

产品编号 品名 添加到购物车
T0303 来自猪胰腺的胰蛋白酶IX-S型冻干粉,13,000-20,000 BAEE单位/mg蛋白质
T4799 来自猪胰腺的胰蛋白酶冻干粉,1,000-1,500 BAEE单位/mg固体,经细胞培养测试
T7409 来自猪胰腺的胰蛋白酶II-S型冻干粉,1,000-2,000 BAEE单位/mg固体
T5266 来自猪胰腺的胰蛋白酶,1,000-1,500 BAEE单位/mg固体,经γ照射,经细胞培养测试
T7168 来自猪胰腺的胰蛋白酶片剂,1 mg片剂

用于细胞解离的胰蛋白酶溶液
 

产品编号 品名 添加到购物车
T4549 来自猪胰腺的胰蛋白酶溶液,10×,每升0.9%氯化钠溶液中含25 g猪胰蛋白酶,经无菌过滤,经细胞培养测试
T4674 来自猪胰腺的胰蛋白酶溶液,10×,每升酚红汉克平衡盐溶液中含25 g猪胰蛋白酶,经无菌过滤,经细胞培养测试
T4424 来自猪胰腺的胰蛋白酶溶液,1×,每升酚红汉克平衡盐溶液中含2.5 g猪胰蛋白酶,经无菌过滤,经细胞培养测试
T4049 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液,每升酚红汉克平衡盐溶液中含2.5 g猪胰蛋白酶和0.2 g EDTA • 4Na,经无菌过滤,经细胞培养测试
T3924 胰蛋白酶-EDTA溶液,1x,每升酚红汉克平衡盐溶液中含0.5 g猪胰蛋白酶和0.2 g EDTA • 4Na,经无菌过滤,经细胞培养测试
T4299 胰蛋白酶-EDTA溶液,1×,每毫升不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中含500 BAEE单位猪胰蛋白酶和180 μg EDTA • 4Na,经无菌过滤,经细胞培养测试
T4174 胰蛋白酶-EDTA溶液,10x,每升0.9%氯化钠溶液中含5.0 g猪胰蛋白酶和2 g EDTA • 4Na,经无菌过滤,经细胞培养测试

 

 参考文献

  1. Cunningham, L. W. Jr., Molecular Kinetic properties of crystalline diisopropyl phosphoryl trypsin. J. Biol. Chem.211, 13-19 (1954).
  2. Walsh, K. A., Trypsinogens and trypsins of various species. Meth. Enzymol.19, 41-63 (1970).
  3. Keil, B., in The Enzymes, 3rd ed., Vol. III, Boyer, P. D., Academic Press (New York, NY: 1971), pp. 250-275.
  4. Shaw, E., et al., Evidence for an active center histidine in trypsin through use of a specific reagent, 1-chloro-3-tosylamido-7-amino-2-heptanone, the chloromethyl ketone derived from Nα-tosyl-L-lysine. Biochemistry4(10), 2219-2224 (1965).
  5. Tietze, F., Molecular kinetic properties of crystalline trypsinogen. J. Biol. Chem.204(1), 1-11 (1953).
  6. Chen, J-M; Ferec, C., Genes, Cloned cDNAs, and Proteins of Human Trypsinogens and Pancreatitis-Associated Cationic Trypsinogen Mutations. Pancreas21, 57-62 (2000)
  7. Burdon, R. H., et al., in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 9, 2nd ed., Allen, G., ed., Elsevier/North (New York, NY: 1989), pp. 73-104.
  8. Enzyme Handbook, Vol. II, Barman, T. E., Springer-Verlag (New York, NY: 1969), pp. 618-619.
  9. Enzyme Handbook, Vol. II, Barman, T. E., Springer-Verlag (New York, NY: 1969), p. 819.
  10. Sipos, T., and Merkel, J. R., An effect of calcium ions on the activity, heat stability, and structure of trypsin. Biochemistry9(14), 2766-2775 (1970).
  11. Bergmeyer, H.U., Gawehn, K., and Grassl, M. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed) Volume I, 2nd ed., 515-516, Academic Press, Inc.,New York, NY
  12. Wang, S. S., and Carpenter, F. H., Kinetics of the tryptic hydrolysis of the oxidized B chain of bovine insulin. Biochemistry6(1), 215-224 (1967).
  13. Carpenter, F. H., Treatment of trypsin with TPCK. Methods Enzymol., 11, 237 (1967).
  14. Methods of Molecular Biology, Vol. 3, Smith, B. J., Humana Press, (New Jersey, 1988), pp. 57-69.