GE免疫印迹技术

简介,摘自GE Healthcare Life Science, 2011“免疫印迹原理和方法

简介

Western blotting,也称为免疫印迹技术,是一项成熟并广泛应用的蛋白质检测和分析技术。免疫印迹技术基于抗体能够与固定在膜上的蛋白质特异性结合的原理,建立一种抗体-蛋白质复合体,进而采用多种检测方法检测结合并固定的抗体。自从1979年免疫印迹技术面世以来[1],该技术即成为生命科学领域最为常用的方法之一。

本手册旨在指导并激励新人和专家成功应用免疫印迹技术。其中提供了专业知识和技术支持,涵盖了从样本处理到检测、分析的完整免疫印迹工作流程。该手册第2到8章内容遵循免疫印迹技术的试验步骤和流程,内容涵盖理论知识、实际操作以及有用的提示和技巧。第9章内容主要介绍免疫印迹技术经典应用实例及该技术的一些新试验方法。第11章介绍了试验操作指南及试剂配方,包括了免疫印迹的推荐标准操作程序,旨在帮助读者设计和开展试验。在过去的几十年中,不断改进的检测方法及软件使得免疫印迹技术能够开展定量分析,这本手册提供了试验实例及操作方法,以帮助读者改进免疫印迹试验方法并获得更多的定量检测数据。最后,为了确保读者顺利开展试验,第10章提供了问题指南。

读者可以在GE Healthcare获得一系列的方法学手册,其中很多手册涵盖了与免疫印迹技术相关的内容,比如二维凝胶电泳的样本处理方法等。我们在这本手册网络在线版本的相关内容中提供了其它相关手册的PDF链接。

 

免疫印迹技术工作流程

尽管不同的免疫印迹技术试验操作指南在细节上存在差异,但是为了满足蛋白质的特点和所要求涵盖的信息,这些试验操作指南均遵循一些基本的、通用的操作步骤。

比如说,待测目标样本在进行电泳分析前必须进行某种程度上的预处理。其样本可能是一种复杂的蛋白质混合物(例如细胞或组织提取物),也可能是一种纯化蛋白质样本(如纯化后的蛋白片段)。

样本通过电泳分析后达到蛋白质分离的目的,分离的蛋白质经过后续的电转步骤固定在转印膜上。膜上的非蛋白质结合区域则被封闭以防止抗体非特异性结合。该转印膜随后同能够特异结合目标蛋白的一级抗体一起孵育。未结合的抗体通过洗涤步骤被除去,然后采用与酶或者荧光物质或同位素偶联的二级抗体进行后续检测。来自蛋白质-抗体-抗体复合物的检测信号与结合在膜上的蛋白质含量成比例相关。

最常用的检测技术是化学发光技术,该方法采用二级抗体与辣根过氧化物酶偶联。在加入含有氧化基团的试剂后,辣根过氧化物酶催化鲁米诺发生反应并释放出光。这种光信号可以被电耦合(CCD)相机成像仪捕获,或者通过X-光胶片显影捕获光信号。荧光检测是较新的一项检测技术。荧光检测技术中二级抗体被标记上荧光基团,例如CyDye。该荧光信号可以直接被激光扫描仪捕获,或者被配有合适光源和滤光片的CCD相机成像仪捕获。无论采用哪种检测技术,应用分析软件使得与蛋白含量相关联的信号强度可视并预估,同时也可以应用分析软件进行定量分析。

 

GE Healthcare 及免疫印迹技术

自从1990年的第一代应用于免疫印迹技术的增强型化学发光(ECL™)检测试剂—即Amersham™ ECL试剂面世以来,  GE Healthcare的产品手册经历了不断的改进和优化,包括了免疫印迹技术的相关需求,涵盖了从电泳和电转移仪器到高灵敏度的检测系统和软件。通过优选这些优化后的仪器、凝胶、探针、封闭物、二级抗体、检测试剂、成像系统和软件, GE Healthcare能够让您遇到尽量少的困难的前提下,取得成功的试验结果。

 



化学发光

化学发光技术的定义是,通过过氧化物酶催化鲁米诺的多步骤氧化反应进而释放出光信号。增强型化学发光(ECL)是通过化学增强剂和催化剂的作用,使化学发光反应的光信号强度和光释放持续时间得到显著增加。ECL反应中产生的光信号在5到20分钟时达到最高峰并随后逐渐减弱,具体时间和所采用的试剂特点相关。化学发光反应释放的光信号最大峰在波长425nm,该光信号可以被CCD相机或者X-光胶片显影技术所捕获。

以辣根过氧化物酶偶联的二级抗体为基础的ECL技术已经成为免疫印迹技术中最为常用的检测技术。该技术具有较高的检测灵敏度,其释放的光信号与抗体含量呈比例关系。该技术可检测并定量微量蛋白含量。

Amersham ECL

Amersham ECL试剂是一种灵敏的化学发光检测试剂,广泛适用于检测免疫印迹检测应用,用于检测中等含量蛋白质。 当目标蛋白为非痕量表达,且需要确认目标蛋白时,该试剂则是绝佳选择,如蛋白纯化过程中蛋白确认以及检测重组蛋白的表达。

Amersham ECL Prime试剂

Amersham ECL Prime是一种化学发光检测试剂,旨在为用户提供高灵敏度和信号持久的试剂。该试剂较强的光信号使之成为CCD相机成像仪的首选,例如ImageQuant™ LAS 4000成像仪,当然同样您还可采用X-光胶片显影。另外,较强的信号强度允许用户应用低浓度蛋白质达到持续的试验结果。微量水平的蛋白质可以被检测到,并且在较宽的浓度水平由良好的线性关系,这使得用户能够得到高精度的定量分析结果。Amersham ECL Prime试剂可应用于各方面实际应用中,如果用户对免疫印迹试验由高灵敏度的定量要求,我们着重推荐这个试剂。

 

荧光

荧光是由特定波长的激发光激发荧光基团并释放出另一吸收波长的荧光。配有合适的激发光光源和吸收光滤光片的成像仪可以完成荧光激发和所释放荧光的检测功能。

荧光检测是免疫印迹技术中的一项相对较新的技术,相对于化学发光检测而言,荧光检测有下述的技术优势。荧光信号可以直接被荧光标记的二级抗体所检测到,该过程不需要添加其它额外试剂。荧光信号相对稳定并且不会很快衰减。该技术是一项非常灵敏的检测技术,其荧光信号和蛋白质含量成比例相关。同时还有,如果二级抗体被标记上不同的荧光基团,该技术可同时检测多种不同蛋白质。以上这些优点使得荧光检测技术成为定量和多重样本分析。

Amersham ECL Plex试剂

Amersham ECL Plex荧光检测系统为免疫印迹定量检测提供了高灵敏度、宽线性动态范围、以及高适用性。转印膜上的荧光信号可以稳定长达三个月,光信号不仅能够被多通道荧光成像仪检测,同时还可被配有适合光源和滤光片的CCD相机成像仪检测。

不同波长的吸收光使得该试剂可进行复杂样本分析检测,即最多可同时检测同一张膜的三种蛋白质。这使得Amersham ECL Plex成为定量检测应用的首选,因为目标蛋白和内参蛋白(如管家蛋白)可同时被检测而不需要分离条带并重新染色。另外,具有相近分子量的蛋白质也可被同时检测,如磷酸化蛋白和对应的未磷酸化修饰的蛋白质。

 

化学荧光

化学荧光是由碱性磷酸酶催化底物试剂将其转化为荧光物质并释放出荧光信号。配有合适激发光光源和滤光片的成像仪可以激发荧光物质并检测荧光信号。

当碱性磷酸酶替代辣根过氧化物酶与二级抗体偶联,化学荧光检测方法成为免疫印迹技术的另一选择。该方法的灵敏度低于化学发光法,但是信号更加稳定。

Amersham ECF

Amersham ECF是ECL灵敏度相近的化学荧光检测系统。该系统的信号比化学发光信号更为稳定,其信号由荧光扫描仪检测到。它可以应用于用于免疫印迹检测中非痕量蛋白质的检测,如蛋白纯化过程中蛋白确认以及检测重组蛋白的表达。

 

材料

     

 

参考文献

  1. Towbin, H. et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 76, 4350-4354 (1979).