西方蛋白印迹的样品制备

第2章,摘自 西方蛋白印迹的原理与方法
GE Healthcare Life Science, 2011

符号

该符号表示关于如何改进工作流程所给出的一般性建议,以及在特定情况下建议采取的措施。
** 是指第三方商标。

 


 样品制备

 

良好的样品制备的重要性无论怎么强调都不过分。通过理解您的起始样品的性质,对您希望从您的西方蛋白印迹实验能够获得的信息有一个清楚的设想,可以提高成功分析的机会。因此,本章的重点是样品制备良好作业规范的一些基本规则,以保证您从一开始就正确操作。关于样品制备的更详细信息,请参见GE Healthcare的手册 蛋白样品的制备 (1)。本章将集中说明最影响西方蛋白印迹的那些问题。


 引言

原则上说,所有蛋白来源,从单细胞到整个组织,以及胞外基质、生物体液以及体外分泌的蛋白,都可用西方蛋白印迹法分析。尽管悬浮的哺乳动物细胞等来源在温和条件下容易被破坏并且容易释放其蛋白质,但是从深深嵌入完整组织或实体瘤中的细胞中提取蛋白质则很困难。由于存在围绕并保护活细胞的刚性富含碳水化合物的细胞壁,从植物、细菌和真菌中提取蛋白质变得更加复杂。

然而,无论感兴趣的来源和蛋白质如何,目标必须是设计足够的提取程序以获取和破坏细胞,而又不会不可逆地改变目标蛋白质,同时获得足够材料产量,且纯度水平可以接受。

  样品制备 — 轻轻操作!保持冷静!

  • 使用尽可能温和的提取程序:过度剧烈的细胞或组织破坏可能直接使目标分子变性,形成永久性蛋白质复合物,引起化学修饰,或导致区室化蛋白水解酶的释放。
  • 如果可能的话,在适当的缓冲液存在下在冰上快速提取蛋白质,以维持pH、离子强度和稳定性,以防止蛋白质降解。提前冷冻设备,并让样品始终在冰上。

生物基质非常复杂。目标蛋白质可能是样品中存在的数千种蛋白质中的一种,除此之外还有核酸、多糖和脂质,所有这些都可能干扰分析。投入提取和纯化的努力多少取决于最终目标,例如,如果目的是检测低丰度蛋白质,则建议使用诸如免疫沉淀的技术从样品中亲和分离该特定蛋白质。另一方面,使用实际天然样品可以令人满意地完成对稳健和丰富蛋白质的分析。

提取方法的选择主要取决于样品以及分析是针对细胞中的所有蛋白质还是仅针对来自特定亚细胞级分的组分。

此外,由于内源性蛋白酶可以在细胞破裂后释放并且可以降解靶分子,因此应当在细胞破碎期间保护样品并随后通过使用蛋白酶抑制剂混合物进行纯化,以避免不受控制的蛋白质损失。

许多方法可用于破坏细胞并通过蛋白质印迹制备其内容物用于分析。表2.1列出了一些最流行的提取方法,并指出了它们对特定细胞或组织来源的治疗的适用性。通常,当样品由易于裂解的培养细胞或血细胞组成时,采用温和的方法,如要破坏更坚固的细菌或植物细胞,或嵌入结缔组织的哺乳动物细胞,则采用更有力的方法。

表2.1. 不同细胞和组织的提取方法一览

 

样品 典型的裂解方法
组织培养物 去垢剂裂解
细胞悬浮液 超声波破碎法
大多数植物和动物组织 机械均质化(例如Waring** 搅拌器或Polytron**)
软动物组织和细胞 Dounce(手动)和/或Potter-Elvehjem(机械)均质化
细菌和哺乳动物细胞 冷冻/解冻裂解
细菌、红细胞、培养细胞 通透压冲击法裂解
固体组织和植物细胞 用研钵和研杵手工研磨
细胞悬浮液、酵母细胞 用摩擦性物品(例如沙子、玻璃珠、矾土等)研磨
细菌、酵母、植物组织、真菌细胞 酶解
细菌、酵母、植物细胞 爆炸减压(氮气蚀)
有胞壁的微生物 法式压滤
植物组织、真菌细胞 玻璃珠研磨


 蛋白提取方法

基于去垢剂的裂解

去垢剂裂解是用来处理哺乳动物细胞的最常用的一种方法。细胞悬浮液轻轻离心,并重悬于含有去垢剂的裂解液中。溶解胞膜,裂解细胞并释放其内容物。粘附细胞,如成纤维细胞,可以通过添加裂解溶液,直接被溶解在组织培养表面上,或者可以首先在非裂解缓冲液存在下,使用橡胶手术刀从表面上刮下,然后离心,并作为细胞悬浮液处理。使用温和的非离子型去垢剂,如Triton ** X-100,壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP40)或两性离子去垢剂,如3 - [(3-胆酰胺丙基)二甲基铵] -1-丙磺酸盐(CHAPS),有助于确保目标蛋白质的变性保持在最低限度。

冷冻/解冻裂解

该方法适用于哺乳动物或细菌细胞的悬浮液。冷冻/解冻裂解法的主要吸引力是简单和低成本。通过重复形成冰晶破坏细胞,该方法通常与酶裂解结合使用。可以使用液氮快速冷冻细胞悬浮液。然后将样品解冻,并在室温下通过移液或在裂解缓冲液中温和涡旋重悬,并重复该过程数次。在循环之间,将样品离心,并保留上清液。

渗透压冲击法

这是一种非常温和的方法,可以在不使用去垢剂的情况下裂解悬浮的哺乳动物或细菌细胞。该方法通常与机械破碎相结合,依赖于从高渗透介质到低渗透介质的变化,并且非常适合于随后将裂解物分馏成亚细胞组分的应用。

超声波破碎法

这种蛋白质提取方法最常用于细胞悬浮液。通过插入样品中的探针,细胞被高频声波(通常为20至50kHz)破坏。声波产生一个低压区域,导致

探针尖端附近的细胞膜破裂。应在短的冲击波内对细胞悬浮液进行超声波处理以避免加热,并且样品应在两个冲击波之间在冰上冷却。这适用于小规模样品制备。蛋白质聚集体(包涵体)必须重新溶解。虽然相对简单,但超声波破碎法是一种严格的样品制备方法,其中必须持续控制产生的热量,并且敏感的目标分子可能易受剪切力的影响。

  对于蛋白质制剂,DNA的释放可导致难以处理的高粘度样品。添加DNase可以降低粘度。

机械方法

可以使用许多粗略但有效的“压碎和研磨”措施从细胞和组织中提取蛋白质。例如,当样品被迫通过狭窄的间隙时,细胞膜可能被”液体剪切力“破坏:间隙越紧,剪切力越大。这可以通过dounce均质化手动或通过Potter-Elvehjem均质化机械地实现。这种温和的方法特别适用于小量细胞和培养的细胞。

通过在冷冻缓冲液中切碎制备的组织,其均质化可以使用Waring搅拌器或Polytron实现。Polytron与Waring搅拌器的不同之处在于,它将组织拉入包含旋转叶片的长轴中。有不同容量的轴提供,允许最小样品大小为1 ml。

研钵和研杵:组织或细胞通常在液氮中冷冻并研磨成细粉。添加矾土或沙子可有助于研磨。细胞壁被机械力破坏。

玻璃珠研磨:用细小玻璃珠快速搅拌细胞会破坏细胞壁。珠磨将溶解大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,包括分枝杆菌。

酶解

当从具有被强健的保护结构包围的细胞膜的细菌、酵母或其他生物体中提取蛋白质时,经常使用酶解法。这些酶溶解细胞壁、外层、胞囊、衣壳或其他不易单独用机械方法剪切的结构。酶解之后,通常在裂解缓冲液中进行均质化、超声处理或剧烈涡旋处理。酶解法最常用于细菌和酵母,但也可用于从嵌入纤维组织的真核细胞中提取蛋白质,举例来说,在这种应用中,胶原酶可能适合于增强纤维状胶原的分解。有关酶及其用途的汇总,请参见表2.2。

表2.2. 酶解细菌和酵母细胞

 

描述 注释
溶菌酶 溶菌酶也称为胞壁酶或N-乙酰胞壁酰胺聚糖水解酶,是一类酶,它通过催化N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基之间的1,4-β-键水解来破坏细菌细胞壁。 主要用于细菌细胞
酶解酶** 主要的酶活性是β-1,3葡聚糖酶和β-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶,它们以β-1,3-葡聚糖键水解葡萄糖聚合物,释放昆布五糖作为主要产品。 主要用于酵母
溶葡球菌酶 A 金黄色葡萄球菌金属内肽酶,特异于细胞壁葡萄球菌肽聚糖 主要用于葡萄球菌

可以作为一种非常有效的抗葡萄球菌药物

 

急遽减压

该技术通常应用于细菌、酵母、植物细胞或其他强健样品。细胞用惰性气体,例如氮气,在高压(通常5500kPa / 800psi)下平衡。使用法式压力机,当样品从高压腔室通过孔口转移到低压腔室时,该方法通过快速压降起作用。这是一种快速有效的方法,适用于大量处理。

预制裂解缓冲液和样品制备试剂盒

GE Healthcare提供一系列用于从哺乳动物细胞、酵母、细菌和动物组织中提取蛋白质的产品。

样品研磨试剂盒可用于破坏小组织和细胞样品以进行蛋白质提取。每个试管最多100mg样品可在约10分钟内处理完毕。该试剂盒由若干微量离心管组成,每个微量离心管含有少量悬浮在水中的研磨性研磨树脂和一次性研杵。首先将试管离心,以沉淀树脂并除去水。然后将所选择的提取溶液和样品加入管中,并使用研杵研磨样品。离心后,细胞碎片和研磨树脂牢牢地沉淀在管的锥形底部,上清液很容易去除

illustra™triplePrep™试剂盒专为从动物组织和哺乳动物细胞的未分割样品中快速分离和纯化高产基因组DNA、总RNA和总变性蛋白而设计。该工作流程减少了总步骤数,使得能够在不到1小时内制备所有三种分析物。缓冲液、色谱柱和操作规程确保从有限的样品(如活组织检查、存档组织和肿瘤)中获得高回收率。

哺乳动物蛋白质提取缓冲液设计用于从哺乳动物培养细胞中有效、温和地提取具有生物活性、且完全可溶的蛋白质。该缓冲液基于有机缓冲液,可用于细胞悬浮液和贴壁细胞。

酵母蛋白质提取缓冲液试剂盒可用于从酵母细胞中提取可溶性蛋白质,是对基于酶解的原生质球制备和从酵母细胞中提取可溶性蛋白质的专有改进。该试剂盒具有制备原生质球并在裂解和提取酵母蛋白质之前去除裂解酶Zymolyase的方案。缓冲液基于含有温和非离子去垢剂的有机缓冲液,各种盐和试剂的专有组合,增强了28-9998-97 AB19蛋白的提取和稳定性。还提供了即用型酶解酶的制备。根据应用,可以添加其他试剂,例如还原剂、螯合剂和蛋白酶抑制剂。酵母蛋白质提取缓冲液试剂盒无需对酵母细胞进行费力的玻璃珠裂解。

2-D分馏试剂盒通过减少加载到凝胶基质中的蛋白质种类的量和个数,简化了复杂蛋白质混合物的分析。分馏使得可以从总蛋白质组中分离蛋白质组或组分。这允许在分析单个组分时提高分辨率,提供不太拥挤的2-D图,简化分析和解释,并增加发现具有诊断或治疗意义的新蛋白质的机会。这些可扩展的试剂盒有助于确保高样品回收率,并与下游分离技术(如2-D凝胶电泳)兼容。

保护您的样品

裂解缓冲液中必须包含蛋白酶抑制剂,以防在细胞裂解过程中,内源性蛋白酶释放后蛋白质的降解。

蛋白酶抑制剂混合物:样品制备通常需要抑制蛋白酶活性。GE Healthcare提供这种独特的竞争性和非竞争性蛋白酶抑制剂组合,可在动物组织、植物组织、酵母和细菌的纯化过程中保护蛋白质免遭蛋白质水解。含有丝氨酸、半胱氨酸和钙蛋白酶抑制剂的混合物,有效抑制95%以上的蛋白酶活性,并专门用于2-D凝胶电泳研究中的样品制备。另外还可以选择加入乙二胺四乙酸(EDTA),以抑制金属蛋白酶。

虽然在蛋白质提取过程中,将蛋白酶保持在非活性状态非常重要(表2.3),但也应考虑其他可能带来不利影响的污染物。例如,如果您的西方蛋白印迹的目的是检测磷酸化蛋白质,重要的是保护您的样品免受样品制备过程中释放到裂解液中的磷酸酶的去磷酸化作用。保护样品的一种方法是在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂,如钒酸钠。也可能有必要保护蛋白质免受不需要的修饰,如乙酰化、泛素化或糖基化。

表2.3. 裂解缓冲液中的蛋白酶抑制剂

 

抑制剂 目标 说明
抑肽酶 丝氨酸蛋白酶 还抑制相关的蛋白水解酶
胰凝乳蛋白酶抑制剂 胰凝乳蛋白酶,胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶,乳糖酶和溶酶体半胱氨酸蛋白酶 植物提取物的常见混合成分
亮肽素 半胱氨酸,丝氨酸和苏氨酸蛋白酶 常见混合成分
Pefabloc** 丝氨酸蛋白酶(例如胰凝乳蛋白酶),激肽释放酶,纤溶酶,凝血酶和胰蛋白酶 不可逆抑制剂。特性类似于苯甲基磺酰氟(PMSF),但在低pH下更稳定。
胃蛋白酶抑制剂 天冬氨酰蛋白酶 抑制几乎所有具有高效力的酸性蛋白酶

常见的混合成分
PMSF 丝氨酸和硫醇蛋白酶 水中迅速降解。原液通常在溶剂中制备,例如二甲基亚砜(DMSO)。

通过还原剂如二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇灭活。


 样品清理

通常不需要在1-D凝胶电泳之前处理样品,但样品清理在2-D凝胶电泳应用中非常重要。然而,如果您遇到分离问题,例如模糊条带,样品清理可能会通过去除潜在的干扰化合物(如核酸、多糖和盐)来提高性能。例如,添加DNase可用于解决由核酸释放引起的粘度问题。表2.4列出了常见污染物和处理它们的措施。

表2.4. 可能影响下游分析的污染物

 

污染物 污染物去除原因 技术
内源性小离子分子,如核苷酸、代谢物、磷脂 这些物质通常带负电,并可能干扰一些下游分析 三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀

用TCA、硫酸铵1或苯酚/乙酸铵沉淀样品,然后离心

在十二烷基硫酸钠(SDS)或在高pH下溶解样品2
不溶物 样品中的不溶物质可以阻塞凝胶的孔隙 离心或过滤
离子型去垢剂 离子型去垢剂,如SDS,通常在蛋白质提取和溶解过程中使用,但可能会强烈干扰某些下游分析 稀释成含有两性离子或非离子型去垢剂(如CHAPS、Triton X-100或NP40)的溶液

丙酮沉淀蛋白质将部分去除SDS — 室温下沉淀将最大限度地去除SDS,但蛋白质沉淀在-20°C时更完全
用TCA、硫酸铵或苯酚/乙酸铵沉淀样品,然后离心1
脂质 许多蛋白质,特别是膜蛋白,与脂质复合 — 这会降低它们的溶解度并影响等电点(pI)和分子量。

脂质与去垢剂形成不溶性复合物,降低去垢剂作为蛋白质增溶剂的效力

当富含脂质的组织的提取物被离心时,通常存在难以去除的脂质层
强烈变性的条件和去垢剂可以最大限度地减少蛋白质 - 脂质相互作用 —— 可能需要过量的去垢剂

用丙酮沉淀去除一些脂质

用TCA、硫酸铵或苯酚/乙酸铵沉淀样品,然后离心1

在SDS或在高pH2下溶解样品
芳香化合物 酚类化合物存在于许多植物组织中
并且可以通过酶催化的氧化反应修饰蛋白质
在萃取过程中存在还原剂,如DTT或β-巯基乙醇,可以减少酚类氧化。
通过沉淀快速分离酚类化合物中的蛋白质。
用二乙基二硫代氨基甲酸或硫脲等抑制剂灭活多酚氧化酶。
通过吸附到聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)来去除酚类化合物
多糖 多糖可以阻塞凝胶的孔隙

一些多糖带负电荷,可以通过静电相互作用与蛋白质复合
用TCA、硫酸铵或苯酚/乙酸铵沉淀样品,然后离心1

超速离心将去除高分子量多糖

在SDS或高pH2值下溶解样品
从样品制备中携带的盐、残留缓冲液和其他带电荷的小分子 盐干扰了一些下游分析 透析

旋转透析

凝胶过滤

沉淀/再悬浮
核酸 干扰迁移并堵塞培养孔 添加DNase
1 使用硫酸铵沉淀需要随后有脱盐步骤。
2 对于2-D凝胶电泳,必须除去SDS。

样品清理产品

SDS-PAGE清洁试剂盒设计用于制备由于存在盐或蛋白质浓度低而难以分析的样品(图2.1)。该试剂盒使用沉淀剂和共沉淀剂的组合来定量沉淀样品蛋白质,同时在溶液中留下干扰物质,例如去垢剂、盐、脂质、酚类和核酸。通过离心沉淀蛋白质。进一步洗涤沉淀以除去非蛋白质污染物,并再次离心。将得到的沉淀重新悬浮,与SDSPAGE样品缓冲液混合,并加热。然后将样品准备用于SDS-PAGE。该程序可在2小时内完成。

   A     B

 

图2.1. SDS-PAGE清洁试剂盒与乙醇沉淀的比较。(A)用10份乙醇沉淀的尿蛋白。(B)用SDS-PAGE清洁试剂盒沉淀的尿蛋白。
凝胶:8×9 cm,12.5%丙烯酰胺,0.1%SDS,在SE 260 Mini-Vertical装置上运行。
染色:考马斯**蓝R-250。

 

2-D 清洁试剂盒设计用于制备2-D凝胶电泳样品(图2.2),但也可用于西方蛋白印迹应用。试剂定量沉淀蛋白质,同时在溶液中留下干扰物质,例如去垢剂、盐、脂质、酚类和核酸。用2-D 清洁试剂盒处理样品大大提高了2-D凝胶电泳结果的质量,减少了条纹、背景染色和其他人为现象。有关2-D清洁试剂盒的更多信息,请参阅GE Healthcare的 2-D电泳、原理和方法手册(2)。

                 A                                B

图2.2. 2-D清洁试剂盒消除了残留SDS造成的大部分水平条纹。
样品:用4%SDS、40mM Tris碱提取大鼠肝脏。
第一维:大约20μg大鼠肝蛋白,Immobiline™ DryStrip (pH 4-7, 7 cm).
Ettan™ IPGphor™ 3等电聚焦单元,单位17.5 kVh。
第二维:SDS-PAGE(12.5%),在SE 260 Mini-Vertical单元(8×9cm凝胶)上运行。
染色:PlusOne™银染色试剂盒,蛋白质。

从血清或血浆样品中消耗高丰度蛋白质

当通过西方蛋白印迹法研究血浆或血清时,丰富的血浆蛋白质(例如白蛋白和IgG)可以模糊不太丰富的蛋白质的信号。预充色谱柱,如HiTrap™白蛋白和IgG消耗色谱柱,设计用来消耗这些潜在问题蛋白的样品,分别去除> 95%白蛋白和> 90%IgG。

1 ml的HiTrap白蛋白和IgG消耗色谱柱,用于从大约150μl未稀释的人血浆或血清样品中去除白蛋白和IgG,含有正常水平的白蛋白(~40 mg/ml)和IgG(~15 mg/ml)。消耗过程大约需要35分钟,可以使用ÄKTA™设计平台的液相色谱系统或蠕动泵进行,亦可使用注射器手动进行。当处理较小的体积时,建议使用专为约50μl人血浆或血清而设计的SpinTrap™ 白蛋白和IgG消耗色谱柱。


脱盐和浓缩样品

在将样品应用于电泳凝胶之前,重要的是溶剂中不含过量浓度的盐或其他低分子量污染物。样品中的含盐过高可能会导致蛋白质以不一致和不可预测的模式迁移。脱盐可以基于凝胶过滤在单个步骤中实现,并且同时将样品转移到所需的缓冲液中。但是,脱盐和缓冲液交换程序通常会导致样品稀释。在电泳应用中,需要相对高的样品浓度,以获得良好的结果,因此可能需要对样品进行浓缩。通过滤膜超滤可以有效且容易地浓缩样品。

表2.5列出了GE Healthcare提供的一些脱盐和浓缩产品。

表2.5. 来自GE Healthcare的脱盐柱

 

产品名称 样品体积 脱盐能力 回收率 排除极限(Mr 化学稳定性
一次性PD-10脱盐柱 1.0 至 2.5 ml >90% 70 至 >95% 5000 所有常用的缓冲液
PD MidiTrap™ G-25/G-10 0.5 至 1.0 ml (G-25)
0.4 至 1 ml (G-10)
>90% 70 至 90% 5000 (G-25)
700 (G-10)
所有常用的缓冲液
PD MiniTrap™ G-25/G-10 0.1 至 0.5 ml (G-25)
0.1 至 0.3 ml (G-10)
>90% 70 至 90% 5000 (G-25)
700 (G-10)
所有常用的缓冲液
HiTrap脱盐柱 0.25 至 1.5 ml >99% 95% 5000 所有常用的缓冲液
Vivaspin** 0.1 至 20 ml 1 >95% 3000 至
100 000
所有常用的缓冲液
1 Vivaspin色谱柱专为样品浓缩而设计,但也可用于缓冲液交换。


 总蛋白浓度的测定

当比较来自在相同凝胶内或凝胶之间的不同泳道中运行的样品的蛋白质的量时,非常重要的是所有泳道都装载有相同总量的蛋白质。如果比较泳道含有两倍于总蛋白质的量,则一条泳道中特定蛋白质的表达水平的翻倍增加将被完全掩盖(或者如果比较泳道含有两倍以上,则表达水平的翻倍增加看起来被降低)。

常规使用几种分光光度法测定溶液中蛋白质的浓度(3)。这些包括测量蛋白质的固有紫外线(UV)吸光度,以及基于蛋白质依赖性颜色变化的方法,例如传统的铜基Lowry测定(4)、Smith铜 / 二辛可宁(bicinchoninic)测定(BCA)(5)和Bradford染料测定(6)。尽管广泛使用,但这些方法都不是特别方便。

例如,UV吸收要求在不含干扰(UV吸收)物质的溶液中获得已知消光系数的纯蛋白质。溶液中蛋白质的近似浓度(假设使用路径长度为1cm的比色皿)可以通过使用以下任一方程式来估算:

A280 = 1 A1 (mL/cm mg) × [浓度] (mg/mL) × 1 (cm)

A205 = 31 A1 (mL/cm mg) × [浓度] (mg/mL) × 1 (cm)


1 A280代表蛋白质在280nm处吸收的光,主要是由于存在环状氨基酸酪氨酸和色氨酸。A205  代表205nm处蛋白质吸收的光,主要是由于氨基酸之间的肽键。


然而,不同的蛋白质在280和205nm处具有广泛不同的消光系数,并且以这种方式获得的浓度估计充其量只是粗略估计。紫外线吸收要求蛋白质溶液不含其他紫外线吸收物质,如核酸,并且使用石英比色皿进行测量。

铜 / BCA测定基于酰胺将Cu 2+还原为Cu +。虽然非常准确,但这些分析需要新制备的试剂溶液,必须在分析过程中仔细测量和混合。然后在严格控制的高温下进行长时间、精确定时的培养,然后立即进行吸光度测量。两种测定都可能受到生化溶液中经常存在的其他物质的影响,包括去垢剂、脂质、缓冲液和还原剂(3) 这要求测定还要包括一系列标准溶液,每种溶液具有不同的已知蛋白质浓度,但是具有与样品溶液相同的组成。

Bradford染料测定基于三种形式的考马斯蓝G染料之间的平衡。在强酸性条件下,染料以双质子化形式(红色)最稳定。然而,在与蛋白质结合后,它以非质子化形式(蓝色)最稳定。

与上述其他测定相比,Bradford染料测定更快,涉及更少的混合步骤,不需要加热,并且提供更稳定的比色响应。然而,该测定倾向于影响非蛋白质来源,特别是去垢剂,并且在其有用蛋白质浓度范围的高端逐渐变得不那么线性。响应还随蛋白质的结构而变化。这些限制使得必须在该测定中使用蛋白质标准溶液。

Bradford染料试剂主要与精氨酸残基反应,并且在较小程度上与组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基反应。因此,该测定对于碱性或酸性蛋白质不太准确,并且对牛血清白蛋白比“平均”蛋白质更敏感,大约两倍。IgG是Bradford染料测定的优选蛋白质标准。

用于测定总蛋白质浓度的产品

紫外线/可见分光光度计的使用在蛋白质分析中很普遍。例如,GE Healthcare的Ultrospec™分光光度计系列提供了蛋白质测定、酶活性动力学、DNA和RNA定量以及馏分分析的模块。这些单元与上述传统的蛋白质测定方法相容。这些仪器配有8个位置的样品转换器,是使用2-D Quant试剂盒测定蛋白质浓度的最佳选择。

此外,Novaspec™Plus可见光分光光度计存储了通过Bradford染料测定、BCA、Biuret和Lowry测定法测定蛋白质浓度的方法,以及吸光度、透射率、OD600和浓度的基本模式。

2-D Quant试剂盒,尽管名称是这样,但可用于许多不同的应用,包括准确测定样品中的蛋白质浓度。该程序通过定量沉淀蛋白质同时留下干扰物质起作用。该测定基于铜离子与存在的任何蛋白质的多肽主链的特异性结合。将沉淀的蛋白质重新悬浮在含铜溶液中,并用比色剂测量未结合的铜。480nm处的吸光度与蛋白质浓度成反比。该测定法对蛋白质浓度的线性响应在0至50μg/ ml范围内,推荐的样品体积为1至50μl。此外,2-D Quant Kit与样品制备中描述的许多技术中使用的大多数试剂兼容,例如SDS。


 参考文献

  1. Protein Sample Preparation Handbook, GE Healthcare, 28-9887-41 Edition AA (2010).
  2. 2-D Electrophoresis, Principles and Methods, GE Healthcare, 80-6429-60 Edition AD (2010).
  3. Stoscheck, C. Quantification of Protein. Methods in Enzymology Vol. 182 (Colowick, S. P. and Kaplan, N. O., eds.), Academic Press, New York (1990).
  4. Lowry, O. et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  5. Smith, P. K. et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  6. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).


 材料