免疫沉淀印迹分析(IP-Western)

IP-Western分析仍作为一种热门的技术来鉴定蛋白-蛋白互作,以及多蛋白复合物中的未知蛋白质。其步骤包括细胞裂解、抗体-抗原(免疫)复合物的形成、免疫复合物的沉淀和Western印迹分析。

点击免疫沉淀印迹分析(IP-Western)主题,以了解相关问题的可能原因和补救措施:

 

高背景

 


高背景,导致印迹的非特异性条带

可能原因

应对措施

与珠子的非特异性结合

  • 使用琼脂糖珠时,进行预清洗步骤。在蛋白混合物中添加未包被的琼脂糖珠(在添加抗体包被珠之前),以去除非特异性结合琼脂糖的蛋白质。
  • 在添加抗体之前,确保用BSA完全封闭珠子。
  • 减少珠子的体积。

洗涤液不够强效

  • 换用更强效的洗涤液,例如基于RIPA洗涤液。

非特异性抗体结合

  • 减少孵育时间,裂解物体积/浓度和/或抗体浓度。
  • 使用特异性更强的抗体。

洗涤不充分

  • 添加更多洗涤液和/或延长洗涤时间。
  • 提高洗涤液效力。
  • 多次颠倒试管以确保充分洗涤。

 

没有目标蛋白被洗脱,或没有足够的目标蛋白被洗脱

 

可能的原因

应对措施

裂解步骤中的蛋白质发生降解、去磷酸化和变性

  • 在4°C下进行所有步骤。确保有足量的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

裂解液过于强效

  • 换用中低效裂解液,例如基于NP-40、Triton®X-100或PBS的裂解液。

抗体未与珠子结合

没有足够的抗体-抗原结合

  • 增加添加到裂解物混合物中的抗体浓度和/或珠子浓度。
  • 延长孵育抗体和裂解液混合物的时间。
  • 在蛋白浓度低或抗体-蛋白亲和力低的情况下,从直接免疫沉淀法转变为间接法。

在沉淀步骤过程中意外去除了琼脂糖珠

  • 确保琼脂糖珠不被吸入移液器中。
  • 使用磁珠代替琼脂糖珠,以最大限度地减少/消除珠子损失。

小鼠IgG或鸡抗体不能有效结合蛋白G-或蛋白-A偶联珠(用于间接免疫沉淀)

  • 在沉淀步骤中添加桥接抗体以改善这些抗体与蛋白质G-或蛋白质A-偶联的珠子的结合。

靶蛋白保留在珠子上

  • 确保适当的洗脱缓冲液类型和pH值。

破坏蛋白质复合物(在共免疫沉淀实验中)

  • 轻轻涡旋并使用宽孔移液器吸头以避免蛋白复合物破坏。

 

最终印迹上50 kDa和20 kDa的额外条带可能掩盖目的条带

 

可能原因

应对措施

二抗同时识别一抗的重链和轻链

  • 使用检测原生(非变性的)免疫球蛋白的二抗。

在交联IP western中,一级捕获抗体的重链和轻链被排除在样品之外。

  • 使用交联IP,首先使用DSS或类似交联剂将蛋白A或G珠子交联至捕获的抗体上。

 

免疫沉淀珠选择指南

材料