shRNA慢病毒文库的功效、特异性和效率检验

Betsy Boedeker,* Gregory A. Wemhoff, Andrea Spencer, Roger Chiu, Suzanne Miller, Henry George, and Edward J. Weinstein

*Corresponding Author: Betsy Boedeker, Functional Genomics, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA 
E-mail: bboedeker@sial.com

介绍

小干扰RNA(siRNA)在培养细胞中的应用提供了一种快速有效的敲低基因表达的方法,也使得siRNA迅速成为了分子生物学中无处不在的工具。尽管已经证实,siRNA在某些转化的哺乳动物细胞系中对短期的基因抑制有效,不过其在原代细胞培养中的应用或用于稳定的转录敲低时存在明显的问题。最近,有文章描述了用于调节人胚胎干细胞(Zaehres等,Stem Cells,2005)以及转基因小鼠(Ventura等,PNAS,2004)中基因表达的位于慢病毒载体上的shRNA文库。我们测试了shRNA慢病毒文库(TRC文库)克服siRNA局限性的能力。我们用16种病毒转导了原代培养的人星形胶质细胞,这些病毒靶向4种不同的基因,且这些基因(p38a,p38d,MAP3K4和JNK2)之前已被证实对星形胶质细胞的功能十分重要。所有的16种病毒都能够成功地稳定感染细胞并敲低靶基因,基因抑制水平从40%至99%不等(与感染对照病毒相比)。我们接下来检查了每种AKT亚型(AKT1、AKT2和AKT3)敲低的特异性,发现对于一个基因来说,shRNA抑制一种目标亚型的同时保留了其他两种异构体。最后,我们测试了一系列细胞系来确定该病毒的感染性范围。除了培养的原代星形胶质细胞以外,该病毒在A549(人肺细胞)、Panc1(人胰腺细胞)、HCT116(人结肠细胞)和HepG2(人肝脏细胞)等肿瘤细胞系中可有效的敲低基因表达。这项研究表明慢病毒载体shRNA可能是广谱细胞中RNA抑制的有效手段,能够做到特异和高效的基因改变并克服siRNA的常见限制。

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综述

应用RNA干扰技术来达到基因沉默和敲低正在成为常规。在某些情况下短发夹结构优于siRNA,因为这些结构可得到更稳定和长期的结果。MISSION™ TRC shRNA慢病毒载体还有另一个优点,那就是它们可以轻松转导一些典型的难以成功的细胞系,如原代星形胶质细胞以及非分裂细胞。这种短发夹载体文库可用于单基因分析、途径阐明甚至全基因组功能筛选等广泛的研究。

我们已经研究了靶向JAK1的四个克隆在感染人肺肿瘤细胞系A549后产生的可变敲低。敲低效果最好的克隆被选出,在其它四种人细胞系中开展进一步的实验。

shRNA对靶标抑制的特异性也非常重要。先前使用siRNA的研究已显示出相当大的脱靶效应(Jackson等,Nat Biotechnol 2003)。人肺肿瘤细胞系A549表达AKT的所有三种亚型(AKT1,AKT2和AKT3)。每个单独亚型的抑制都会导致表型的差异。我们检验了针对三种亚型的的载体,并分析了对其余两种亚型产生的影响。

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实验结果

实验共靶向了四个不同的基因,每个基因最少检验四种不同的shRNA载体。选择的基因都是经鉴定的与正常星形胶质细胞通路相关的基因:JNK2,p38a,p38d和MAP3K4(Hasselblatt等,Neuroreport 2006; Yoo等,Arch Pharm Res 2005)。含有病毒制剂的shRNA成功地转导了100%的经处理过的原代星形胶质细胞。用嘌呤霉素筛选后,得到了不同水平的敲低(图1)

图1.  直接靶向p38a,p38d,JNK2和MAP3K4的MISSION TRC shRNA慢病毒颗粒被用于转导人原代星形胶质细胞。感染后114小时,纯化总RNA并用合适的TaqMan®基因表达分析系统来进行分析。结果用GAPDH来标准化。空载体对照的水平用百分比表示(100%)。

七个靶向JNK2的载体中,有五个可下调大于90%的mRNA表达。其它的两个载体分别导致了无显著性敲低和62%的内源mRNA表达敲低。共有七种不同的载体靶向p38a基因,敲低水平从约70%到20%不等。靶向p38d和MAP3K4基因各有四种载体。其中针对p38d的载体中有两个敲低效率大于95%。另外两个p38d载体,经三次重复实验发现,在45个扩增循环后没有可辨别的 Ct值。这表明靶基因被完全抑制,mRNA水平已降低至qRT-PCR技术的检测极限之下。靶向MAP3K4的载体导致的基因沉默范围从42%至74%。所有实验均使用感染空载体对照病毒的细胞(货号SHC001V)作为表达改变的阴性对照。

我们接下来想确定可能受此shRNA慢病毒文库感染的细胞类型的范围。我们选择了JAK1基因作为我们的测试目标,并在A549细胞中筛选出四个潜在的JAK1克隆。靶向JAK1基因的shRNA在转导入A549细胞时表现出不同程度的敲低(图2)。两个载体(TRCN0000003102和TRCN000003105)将内源性JAK1的水平降低了80%以上,一个载体(TRCN0000003104)抑制了约75%,而第四个载体(TRCN0000003103)抑制了约40%。使用多个shRNA将JAK1的表达降低75%或更多,则试剂中的有用冗余可以用于概念实验的证明。同时,文库中有shRNA只能部分降低JAK1的RNA水平,可用于检测与该基因相关的任何亚等位基因的表型。我们用GAPDH和亲环蛋白作为内源性对照,发现结果非常相似,表明两种管家基因的任何一个都适用于这些实验。

图2. 用于在包装细胞中产生慢病毒颗粒的人Janus Kinase1(JAK1,NM_002227)MISSION shRNA集合(4个单独的发夹)。用含有shRNA序列的慢病毒颗粒转导A549细胞。感染后140小时,纯化总RNA并用合适的TaqManTM基因表达分析系统来进行分析。用GAPDH(图B)和亲环蛋白(图A)定量RT-PCR结果来标准化。感染的样品和感染的空白对照细胞之间的Ct值差异以及PCR的效率用来说明表达水平的百分比。

 

图3. 用于在包装细胞中产生慢病毒颗粒的人Janus Kinase1(JAK1,NM_002227)MISSION shRNA的一个克隆。用包含shRNA序列和空载体的慢病毒颗粒转导所有五种细胞系。感染后140小时,纯化总RNA并用合适的TaqManTM基因表达分析系统来进行分析。用亲环蛋白定量RT-PCR结果来标准化。

 

图4. 用于在包装细胞中产生慢病毒颗粒的人v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1,2和3(AKT1,NM_005163; AKT2,NM_001626; AKT3,NM_005465)MISSION shRNA个体克隆。用包含shRNA序列的慢病毒颗粒转导A549细胞。感染后140小时,纯化总RNA并用合适的TaqMan基因表达分析系统进行分析。用空载体对照标准化AKT1、AKT2和AKT3的表达水平百分比。敲低AKT1不影响AKT2和AKT3的表达水平(图A)。敲低AKT2不影响AKT1和AKT3的表达水平(图B)。 类似地,敲低AKT3不影响AKT1和AKT2的表达水平(图C)

选取来自JAK1集合的一个克隆(TRCN000003105),用于其他四种细胞类型的后续使用。在每种情况下,JAK1克隆都相对于空载体对照进行比较。无论是测试的五种细胞类型中的哪一种,都可以观察到靶基因的相似的敲低(图3)。这显示了这些病毒颗粒在不同细胞系中的多功能性。

TRC文库中发现的靶向各种AKT亚型的shRNA产生了类似的结果,即在A549的感染中,一些shRNA可导致靶基因的几乎完全下调,而一些产生了中间结果(数据未显示)。然而,特别值得注意的是该文库的特异性(图4)。AKT1靶向shRNA(TRCN0000010174)下调了大约80%的AKT1,而其他两种亚型相对不受影响。 AKT2靶向shRNA(TRCN0000000564)敲除75%的AKT2,但不降低AKT1或AKT3的水平。同样,靶向AKT3的代表性shRNA(TRCN0000010187)可将该基因的内源水平降低约60%,但不会显著影响AKT1或AKT2的水平。注意每个内源基因的水平都被转导空对照载体后的水平所标准化。这些试剂的特异性可允许明确的检验每个AKT亚型减少的影响,鉴于该基因与多个细胞过程的相关性,这也是非常重要的(Fillmore等,Leuk Lymphoma 2005; Yuan等。,J Biol Chem 2005)

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材料和方法

星形胶质细胞培养: 原代来源的正常人星形胶质细胞来自Cambrex(cambrex.com)的冷冻保存。细胞接种于星形胶质细胞基础培养基中(Cambrex),密度为5000个细胞/ cm 2。在70%-80%汇合时,细胞用胰蛋白酶消化并按照1.6×10 4个细胞/孔的密度重新接种到96孔板中。

其它细胞系: 转导前24小时,将人类细胞系铺板至96孔板。将6微升(μl)病毒(除非另有说明)与溴氰酸六甲铵(H9268)一起加入到每个适当的孔中,终浓度为8μg/ ml。 每个转导设三个复孔。约30小时后,去除含有慢病毒颗粒和十六烷基溴化胺的培养基,更换为含有选择性抗生素嘌呤霉素(P9620)(浓度依赖于细胞系)的新鲜培养基。96小时,再次补充培养基和选择性抗生素。最终在转导140小时后收获细胞。

敲低验证: 纯化总RNA,之后使用合适的TaqMan®基因表达分析系统(ABI)进行分析。主要的混合物为Sigma-Aldrich的定量RT-PCR ReadyMix(QR0200),加入MgCl 2(M8787)至浓度为4.875mM,以及适量的水(W1754)。每个样品中加入参考染料作为荧光的内部监测。总反应体积为25或10μl,所有分析中引物/探针混合物的浓度为1x。莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(M1302)在提供的缓冲液中稀释并用于反应的逆转录(15单位)。为了同时测量靶标以及看家基因水平,每个样品要多路复用。 PCR条件如下:42℃15分钟; 94°C 3分钟(初始变性和JumpStart Taq激活);94℃15秒,60℃1分钟,共 45个循环;在60℃延伸步骤期间收集数据,终点检测。所有反应都使用Stratagene Mx3000 qPCR机器和软件来运行和分析。输入RNA用GAPDH或亲环蛋白来标准化。感染样品和感染的空白对照细胞之间的Ct值差异以及PCR的效率用来说明表达水平的百分比。百分比表示为空载体对照的水平,设置为100%。

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总结

RNA干扰正在发展成为研究基因功能和复杂途径的革命性生物学工具。它有可能改变目前的药物发现和治疗领域。MISSION TRC shRNA慢病毒文库可以为该研究领域提供以前无法获得的优势,例如靶点的优秀特异性,高水平的敲低以及长期的基因沉默。随着慢病毒颗粒转导困难细胞系(星形胶质细胞)的能力,该文库将成为未来RNA干扰的重要而全面的工具。

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货号 描述 规格
SHC001V MISSION™ pLKO.1-puro Control Transduction Particles
H9268 Hexadimethrine bromide 5 g
10 g
50 g
100 g
P9620 Puromycin Ready Made Solution 10 ml
QR0200 Quantitative RT-PCR ReadyMix™ 1 kit
W1754 Water, PCR Reagent 1 vial
5 vial
M1302 M-MLV Reverse Transcriptase 40 ku
200 ku

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