通过多重反应监控及Protein-AQUA™对RNAi敲低进行验证

Beth K. Radwanski(照片中人)Shantanu Roychowdhury, Henry Duewel
Sigma-Aldrich生物技术研发部门

介绍

蛋白质组学领域一直在寻找新的方法来研究复杂生物样品中的蛋白质动力学。最近,许多研究人员开始使用RNA干扰(RNAi)作为操纵样品中蛋白质水平的方法,但如何对这些蛋白质进行准确定量仍是一个挑战。幸运的是,在过去的十年中,蛋白质组学在质谱领域取得了重大进展。这些在仪器和方法学方面的进展,为研究人员提供了对复杂样品中蛋白质进行鉴定和定量的灵敏分析方法。本讨论将重点介绍其中的一些方法,即采用多重反应监测(MRM)和Protein-AQUA。

MRM是一种快速增长的多肽定量技术。该技术的实用性在于提高了仪器对经历了特定分裂反应的特定肽离子监测的灵敏度和选择性。在该技术中,将样品引入三重四极质量分析仪,在这里样品将被电离并经历两个质量选择的阶段。第一阶段发生在四极1(Q1)中,将对特定分子量的肽(前体离子)进行选择。该前体离子然后在碰撞室(q2)中经历分裂以形成碎片离子。第二阶段发生在第三个四极(Q3)中,将对特定的碎片离子进行选择。由于多肽是以可预测的方式进行分裂的,所选的碎片离子与目标多肽之间也存在特异性。总的来说,这随之而产生的选择性反应监测(SRM)测定法,对所选择的肽具有高度的特异性和灵敏度,并产生可整合至标准LC-MS实验中的色谱峰。当几种前体到碎片离子的测定在平行进行时,这就被称为多重反应监测。

Proten-AQUA(绝对定量1)利用同位素标记的合成肽作为内参来对内源性肽的丰度进行定量。在该技术中,通过比较内源性肽与已知量的相应AQUA肽™的量来确定蛋白质量。AQUA肽上的重标签会导致质谱发生变化,从而可以轻松与内源性肽进行比较。Protein-AQUA与MRM的结合展现了对肽和蛋白质浓度进行绝对定量一种强大而可靠的方法。

在该工作中,Protein-AQUA和多重反应监测被用于人类子宫颈腺癌(HeLa)细胞中由siRNA介导的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)敲低的验证和定量。共合成了两条AQUA肽并用于LC-MRM实验的内参,来对由不同浓度的GAPD特异siRNA处理的HeLa细胞中由胰酶消化所产生的相应内源性GAPDH肽进行定量。

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材料与方法

细胞培养

人类子宫颈腺癌(HeLa)细胞在含有高葡萄糖和添加有4mM L-谷氨酰胺和10%高质量胎牛血清(F4135)的杜氏改良Eagle培养基(DMEM , D6429)中进行培养。通过采用N-TER™纳米颗粒siRNA转染体系(N2913)将特异性针对于人类GAPDH或一种非编码的siRNA对照转染至这些细胞中。这些siRNA和N-TER体系都是从Sigma-Genosys(The Woodlands, TX)获取的。siRNA/N-TER复合物被稀释成5、10和15nM siRNA的终浓度。空白对照组中加入了单独的N-TER试剂(无siRNA)以及15nM的非编码siRNA。在完成转染后,继续将细胞培养24小时后进行收集(参阅图1)。

 

图1. N-TER纳米颗粒转染体系概览

细胞通过胰酶/EDTA溶液(T3924)进行消化并收集,随后通过离心并使用含有可降解染色体DNA的Benzonase®核酸酶(E1014)的HBSS进行重悬。相同体积的8M尿素也被加入到细胞中并在冰上孵育30分钟。样品通过离心至澄清。采用Bradford试剂(B6916)对蛋白浓度进行测定。

Protein-AQUA

选择合成两段带有>98%13C, 15N标记的赖氨酸(13C615N2)的人类GAPDH肽段,并通过C18反相HPLC纯化至>95%的纯度并用氨基酸分析(Sigma-Genosys, The Woodlands, TX)进行定量。可参阅图2来对AQUA的过程进行总体上的了解。

AQUA 阶段 1: GALQNIIPASTGAAK*
AQUA 阶段 2: VIPELNGK*
*星号代表重赖氨酸

图2. Protein-AQUA方法概览

 

样品(30ug总蛋白)通过ProteoPrep®还原及烷基化试剂盒(PROTRA)进行了还原及烷基化反应,并通过丙酮沉淀进行了浓缩。蛋白沉淀用2M尿素、40mM碳酸氢铵 pH 8.5、9%乙腈进行重悬后,再用胰酶(T6567)进行消化。GAPDH AQUA肽随后按照如下的量加入到30 ug消化后未处理的HeLa细胞裂解液中用于生成标准曲线:50 pmol、5 pmol、500 fmol、50 fmol、5 fmol和0.5 fmol。基于标准曲线的结果,siRNA转染的蛋白消化物(30 ug总蛋白)中加入了0.1%甲酸中30 uL终体积的5 pmol的每种肽段。

图3. LC-MRM分析显示两种AQUA肽段在6个数量级中都展现出了线性的结果。每种内源性肽MRM转化6组重复的CV值分别为3.31%(AQUA肽段1)和2.31%(AQUA肽段2)。

 

MRM 分析

采用配备有(电喷雾)电离源的ABI 4000 QTRAP三重四极分析仪连接的Shimadzu Prominence® HPLC上的Supelco Discovery HS C18(568502-U)柱,通过LC-MRM对样品进行分析。使用串联MS扫描测定MRM的转化(图4)。采用Analyst® 软件(1.4.2版)中定量模块进行色谱峰面积测定,并用峰面积和AQUA加入量作图。该数据用于GAPDH的表达水平定量(图5)。敲低结果通过免疫印迹进行确认(图6)。

图4. 通过将167 fmol的每种AQUA肽段循环注入源中来进行方法开发。为了确定分裂的情况,对优化了碰撞能量的每种AQUA肽段进行串联质谱扫描。内源性肽段与相应的每种AQUA肽段出现相似的图谱。对于AQUA肽段1,选择两个分裂离子确定肽段特异性。

 

图5. 转染后24小时的GAPDH表达。根据方法部分的描述,样品通过LC-MRM进行了分析。AQUA肽段1观察到了两种转化,而AQUA肽段2观察到了一种。对于测量得到的这三种转化,5nm GAPDH siRNA转染的样品在转染后24小时相对于未处理组都有>70%的下降。相应的趋势表明GAPDH表达水平随着siRNA浓度的提高而下降。相应数据都具有生物学重复。

  • 转化1-GALQNIIPASTGAAK: 706.402+ - 815.501+

  • 转化2-GALQNIIPASTGAAK: 706.402+ - 597.301+

  • 转化3-VIPELNGK: 435.302+ - 657.401+

图6. 通过SDS-PAGE分离并固定硝酸纤维素膜上来对含有来自三组对照(未处理,空白对照和非编码对照)以及GAPDH siRNA(5、10和15nM)转染细胞的10 ug总蛋白的裂解液组分进行分析。膜上含有抗GAPDH(G9545)的抗体,并用TMB (T0565)进行孵育,0.1 M甘氨酸-HCl pH 2.0进行剥离,随后在用抗b-肌动蛋白抗体(A2228)进行孵育。

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总结

通过LC-MRM与Protein-AQUA的组合,我们获得了一种高度特异性的方法,用于使用代表性的目标肽对RNAi敲低后的GAPDH水平进行定量。通过将已知量的两种AQUA肽段加入至HeLa细胞裂解物并通过质谱来检测相应的变化。对于两种肽在6个数量级内都观察到了极佳的线性(R2> 0.99),并具有中间amol范围的检测下限。观察到了AQUA肽段1的两个转化,并具有彼此非常一致的定量结果,证实肽对GAPDH具有特异性。每种AQUA肽段观察到不同的绝对蛋白质水平,这可能是由于初级序列不同区域的消化速率不同所致。在这方面的进一步研究将需要使用更多的GAPDH肽段进行LC-MRM分析。在分析GAPDH表达水平时,免疫印迹和Protein-AQUA均得到了到类似水平的敲低。免疫印迹显示用GAPDH siRNA转染的细胞信号明显减少,而对照组信号并没有减少。这与由两种AQUA肽段测量的GAPDH表达百分比之间存在很好的相关性。这种组合方法的高度特异性对于复杂样品中的蛋白质定量显示出了很强大的作用。

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