用于2D和3D细胞培养的可降解聚(乙二醇)水凝胶

Andrea M. Kasko
Department of Bioengineering
University of California, Los Angeles
410 Westwood Plaza, 5121 Eng V
Los Angeles, CA 90095 United States
Email: akasko@ucla.edu

 引言

组织工程学和药物输送等生物技术领域的进展伴随着对各种功能性生物材料的不断增长的需求。几十年来,聚合物生物材料的研究一直集中在测试为其他应用和/或加工程序(例如静电纺丝、溶剂浇铸 / 成孔剂析出、3D打印)而开发的聚合物的生物相容性。
 最近,研究人员已转向合成专门用于生物医学用途的材料,包括合成蛋白质、拟糖物、与水性介质相容的聚合物,以及天然存在的聚合物的化学修饰(例如为了进行凝胶化或增加体内稳定性)。
 在过去十年中,聚合物化学家已经为设计的生物材料创造了一个小众市场,可用作细胞支架和输送药物。

一类吸引浓厚的研究兴趣的生物材料是水凝胶1
水凝胶作为细胞的二维和三维支架得到了广泛研究,因为它们在化学和物理上都非常类似于细胞的自然环境2
水凝胶可以是由合成的 [例如:聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)] 和天然存在的(例如:胶原、透明质酸、肝素)聚合物形成1b,由于其含水量高,且能够在细胞、蛋白质和DNA存在下形成,因此成为有用的组织培养3D模型。
 取决于组成材料的反应性,可以用pH3、温度4、库仑障壁、共价键合、非共价相互作用5或聚合来诱导凝胶化。
 

 PEG

聚(乙二醇)是亲水性聚合物,当其交联成网络时,可具有高含水量。
 PEG是用于生物学应用的合适材料,因为它通常不引起免疫应答6
自20世纪70年代以来,PEG已被用于修饰治疗性蛋白质和肽,以增加其溶解度,降低其毒性,并延长其循环半衰期7。20世纪70年代后期,研究人员开始用PEG水凝胶进行细胞培养试验。PEG水凝胶在化学上是明确定义的,并且有多种化学物质可用于它们的形成和化学修饰。
 

 PEG大分子单体

PEG易于通过环氧乙烷的活性阴离子开环聚合合成;明确定义的(低多分散性)、具有一系列分子量和各种末端基团的PEG(例如:醇、甲基醚、胺、N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯)在市面上可通过多种渠道获得。

为了形成水凝胶,PEG必须是交联的。最初,PEG使用电离辐射非特异性地交联8,现在PEG水凝胶通常通过PEG大分子单体与反应性链端的共价交联来合成。

具有反应性链端的PEG大分子单体如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、烯丙基醚、马来酰亚胺、乙烯基砜、NHS酯和乙烯基醚基团(图1)易于从容易获得的原料合成。PEG的醇链末端可以在碱存在下使用酰氯(例如丙烯酰氯,甲基丙烯酰氯)酯化。PEG链末端可以在碱性条件下通过与烷基卤化物(如:2-氯乙基乙烯基醚或烯丙基溴)反应而醚化。PEG二乙烯基砜通过将PEG与大量过量的二乙烯基砜偶联或通过多步法制备,以制备氯乙基砜链端,其经历碱性消除以形成乙烯基砜基团9
 

PEG大分子单体

表1. 不同PEG大分子单体的末端基团。

大分子单体可以是同双功能的或异双功能的。同双功能大分子单体通常用于形成网络,而异双功能大分子单体可用于将药物分子连接到水凝胶网络中。
 

 水凝胶形成机制

形成水凝胶的交联机制取决于PEG大分子单体的链端的特性。在大多数情况下,交联发生在反应性乙烯基链末端聚合之时,通常与自由基引发剂聚合。例如,大分子单体的聚合可以使用氧化还原产生的自由基(例如过硫酸铵和TEMED)或用光产生的自由基(例如Irgacure® 651,λ= 365nm,方案1)引发。丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯链端经历链聚合。在阶梯型生长网络形成中,多功能(f> 2)交联剂以化学计量的方式与PEG链末端反应;或者,多功能PEG(f> 2)可以与双功能交联剂交联(方案1)。丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基砜、马来酰亚胺、乙烯基醚和烯丙基醚,都能够通过取决于反应条件转化成硫醇而形成阶梯型生长网络。典型的交联剂可包括硫醇或胺基团。混合模式聚合是在同一反应容器中发生的两种机制的结果;丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基团可以经历混合模式网络形成。水凝胶形成的两种机制均可用于包封活细胞,并且这两种机制都允许肽、蛋白质和其他药物的反应性掺入。
 

水凝胶形成机制

方案1. 链型生长和阶梯型生长反应。
 

由不同机制产生的网状结构如图1所示。在链型生长网络中,在交联位点形成动力链,而在阶梯型生长网络中,如果忽略缺陷不计,交联位点具有与多功能交联剂相同的功能。在链型生长和阶梯型生长中,可能存在网络缺陷,例如环、永久缠结和自由悬挂链端。大分子单体的化学特性以及水凝胶形成的机制都很重要,因为每个都影响水凝胶网络的交联密度。通过水凝胶形成的化学性质可以容易地控制对2D和3D培养重要的材料特性。随着交联密度增加,网孔尺寸减小,溶胀比降低,储能模量增加。改变PEG大分子单体的分子量,可以对水凝胶性质进行粗略控制(交联密度的大差异)。改变用于生产水凝胶的反应机制,可对水凝胶性质进行精细控制(可用于调节系统的交联密度)。

形成机制影响水凝胶网络结构和网络缺陷。

图1. 形成机制影响水凝胶网络结构和网络缺陷。
 

 可降解的水凝胶

为了使用3D水凝胶支架来研究细胞分化和组织进化,至关重要的是能够从空间和时间上控制凝胶的物理和化学性质10。聚合物材料特性通常通过聚合 / 交联(键形成事件)改变,或通过受控的降解和/或释放(键断裂事件)改变。键形成事件一般经常使用小分子试剂(与材料缀合的引发剂、催化剂、单体、配体等),而键断裂一般不依赖于外源试剂。与聚合物试剂相比,小分子在体外和体内通常具有更多的不利的作用,因此许多研究团体使用降解作为聚合物生物材料的原位操作工具。
 

 水解降解

水凝胶中最常用的降解机制是水解,在这种机制中,一个水分子加到聚合物主链上,从而造成断链。酸酐、酯和酰胺都易于水解。氢化物通常都水解得太快,而酰胺在没有催化的情况下则水解得太慢,因此大多数水解降解的水凝胶都利用酯键。为了获得具有生理学相关降解时间尺度的可水解降解的水凝胶,研究人员通常使用可降解酯键的丙交酯或乙交酯链片段使PEG官能化。

PEG上的醇链末端可引发3,6-二甲基-1,4-二恶烷-2,5-二酮和1,4-二恶烷-2,5-二酮的开环反应,分别生成PEG-丙交酯和PEG-乙交酯(方案211。开环反应通常由2-乙基己酸锡(II)催化12,尽管使用二甲基氨基吡啶作为催化剂也很容易实现反应13,而且比残留的锡更容易去除。PEG-丙交酯或PEG-乙交酯的醇链末端易于用反应性双键(如丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯)官能化。
 

PEG-丙交酯和PEG-乙交酯的合成。

方案2. PEG-丙交酯和PEG-乙交酯的合成。
 

 酶促降解

尽管酯键是可酶促降解的,但大多数研究人员使用掺入水凝胶中的肽的序列特异性酶促降解而不是酯和酰胺的非特异性酶促降解。Hubbell的研究小组开创了这种方法16,通过半胱氨酸官能化肽与丙烯酸酯、马来酰亚胺和乙烯基砜的迈克尔加成反应,将基质金属蛋白酶(MMP)敏感性连接链掺入到水凝胶中(方案317

MMP可降解的连接键也已用于将药物连接进水凝胶。例如,血管内皮生长因子(VEG-F)等生长因子可以通过酶促降解MMP敏感性系链来释放,从而诱导血管生成18

在水解和酶解中,降解速率由大分子单体的化学特性预先确定。在水解中,材料的降解速率通过可水解基团的特性(例如疏水性或亲水性)和数量来预先设计,并且一旦材料制成就不能再改变。在酶解中,降解通常发生在产生酶的细胞的局部区域。虽然水解和酶解都是持续水凝胶降解和药物持续释放的有效方法,但在水凝胶制成后,就不能调节或阻止释放速率,并且释放是不能空间控制的。
 

方案3. 可以通过含半胱氨酸的肽与乙烯基砜基团的迈克尔加成反应进行酶促降解的水凝胶。

方案3. 可以通过含半胱氨酸的肽与乙烯基砜基团的迈克尔加成反应进行酶促降解的水凝胶。
 

 可光降解的水凝胶

与水解和酶促可降解的键相比,可光降解的连接键可以对降解和释放进行精确的空间和时间控制。虽然许多研究人员报道了可光聚合的水凝胶和可光官能化的水凝胶,但很少有关于生物相容的可光降解的水凝胶的报道。Kloxin和Kasko报道了由含2-甲氧基-5-硝基-4-(1-羟乙基)苯氧基丁酸酯的PEG大分子单体形成的可光降解的水凝胶网络(方案419;正邻硝基苄基(o-NB)连接基团的光降解行为已被充分表征。由可光降解的大分子单体形成的水凝胶在暴露于光时显示出大量降解,这取决于曝光时间、波长和光强度。当光线被遮挡时,会抑制降解;一旦光照恢复,则样品继续光解。包含可光释放的细胞粘附配体RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)的水凝胶所包裹的hMSC(人间充质干细胞)在第10天释放RGD时分化软骨形成通路(对应于纤连蛋白在软骨形成过程中的下调)。这种可降解的水凝胶的表面侵蚀和穿透凝胶光刻技术,可用于在10-7 m至10-2 m或更长的长度范围上形成特征20。局部区域的局部降解导致交联密度降低和溶胀增加,这一特性提供了一种方法,可将较软的特征蚀刻到从凝胶上突出的水凝胶上。

结合到水凝胶主链、并用于药物释放的可光降解的o-NB基团

 

方案4. 结合到水凝胶主链、并用于药物释放的可光降解的o-NB基团。

除了单个光子光解之外,含有o-NB的水凝胶也易受双光子光解,因此能够进行3D蚀刻19-20。在单光子反应中,暴露于光的任何区域都会发生反应。相反,多光子光刻应仅在多个光子同时被吸收的地方发生,其发生在光源的焦点体积处(插图)。生物材料的单光子光刻中的典型波长范围从长波UV(≥365 nm)到可见光区域,而双光子光刻使用红外光(通常~740-800 nm)。红外光更具生物相容性,对活组织的破坏性更小,并提供更大的穿透深度。发生双光子吸收的概率也严格限于聚焦光​​的焦点,而不是沿着整个光路,提供对激发的3D控制。单光子和多光子反应都有可能对特征小于500 nm的材料刻蚀图案,这个尺寸远小于哺乳动物细胞的尺寸21。这代表了对水凝胶支架结构和化学的空前空间控制水平。

单光子光解(左)发生在水凝胶上暴露于紫外至可见光的整个区域,而双光子光解(右)仅在同时吸收红外线两个光子的区域发生。

图2. 单光子光解(左)发生在水凝胶上暴露于紫外至可见光的整个区域,而双光子光解(右)仅在同时吸收红外线两个光子的区域发生。

o-NB连接基团也可用于将药物连接到水凝胶中,以输送至活细胞。Griffin等人的研究证实了通过o-NB-PEG大分子单体将荧光素连接进水凝胶中后的受控释放。该药物模型的释放与多个波长(365-436 nm)、强度(5-20​​ mW/cm2)和持续时间(0-20分钟)的函数关系被量化。虽然最快的释放发生在365 nm(这对应于在该波长下o-NB连接基团的摩尔吸光度较高),但在405 nm处也观察到显著的释放;释放很容易从分子的物理常数(如摩尔吸光度)建模。在这些系统中,光衰减使得能够容易地形成化学和机械梯度。
 

 结论

聚(乙二醇)是容易获得的、且易于改性的聚合物。它已广泛用于水凝胶制造,包括用作组织培养的2D和3D支架。可降解的连接键很容易被引入PEG水凝胶。可水解降解的凝胶允许持续的材料降解和/或药物释放。在可酶促降解的凝胶中,降解和释放取决于细胞。光降解实现了用户实时定制外部操纵水凝胶的化学和物理性质。
 

 材料

     

参考文献

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