石墨烯在生物技术中的应用


 

Alba Centeno and Amaia Zurutuza Elorza* Graphenea S.A.
Tolosa Hiribidea, 76, E-20018 Donostia - San Sebastian, Spain
*Email: a.zurutuza@graphenea.com

 


 石墨烯技术

石墨烯作为新的神奇材料。由碳原子排列成六角形蜂窝晶格结构组成,仅一个原子厚,自2004年用非常简单的方法首次分离和鉴定后,对这种材料的研究兴趣就已成倍增长了。1

石墨烯是不同尺寸的碳纳米材料的合成砌块(图1)。例如,将石墨烯包裹成球,则可得零维富勒烯; 当轧制时,可得一维纳米管; 若堆叠,则可得三维石墨。

石墨烯是其他碳材料的合成砌块。

图1.石墨烯是其他碳材料的合成砌块。

 

石墨烯中的碳原子呈现sp2杂化,并且这种杂化和原子厚度(0.345nm)赋予这种独特材料非凡的特性,例如:即使在室温下也具有极高的电子和空穴迁移率值(>105 cm2V-1s-1) 2在室温下具有非常高的热导率(>4,000 Wm-1K-1);3在可见光谱的大范围内具有2.3%的吸光率;4 机械强度比具有1 TPa杨氏模量的钢高300倍(与相同厚度的钢相比)5;以及对气体(包括氦)的抗渗透性。6 预计石墨烯将在电子,光电子,能源(光能,电池,超级电容器),触屏和显示技术,照明和复合材料等多个领域发挥作用。

此外,石墨烯及其衍生物具有很大的生物医学应用潜力,由于其性质(如高表面积,定制功能性和大sp2杂化表面)赋予的优异的生物相容性,生理溶解度,稳定性及加载或结合不同类型的化合物的能力。表1总结了石墨烯及其在生物技术应用中适宜形式的优点。注意石墨烯有两种不同的合成形式:1)通过化学气相沉积(CVD)形成薄膜; 和2)通过化学剥离的粉末:氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(rGO。石墨烯的性质随形式变化。


 石墨烯在生物医学中的应用

分子,生物分子,量子点,聚合物,甚至纳米粒子均可以加载/结合至石墨烯载体(图2)。这种加载可通过共价键或非共价相互作用来实现; 例如氢键,疏水性,π-π堆积和静电相互作用。

 

石墨烯及其衍生物的生物官能化。经Elsevier许可转载。

图2.石墨烯及其衍生物的生物官能化。经Elsevier许可转载。


 氧化石墨烯在药物和基因递送中的应用

石墨烯及其衍生物是用于设计药物和基因递送的最新材料,包括靶向递送。其可加载水溶性与非水溶性活性化合物并将不同靶向基团连接到氧化石墨烯(GO)血小板上的能力使之可用于靶向或非靶向药物和基因递送。

GO血小板的官能化对于改善石墨烯的生物相容性和溶解性以及实现靶向递送和多种治疗十分重要。GO血小板最常见的化学修饰是共价连接聚合物。许多不同的聚合物基团已成功连接至GO,包括聚乙二醇(PEG,Aldrich货号81300),壳聚糖(Aldrich货号448869)和聚乙烯亚胺(PEI,Aldrich货号 482595)。除了聚合物外,生物靶向配体、DNA、蛋白质、细菌、细胞、量子点和纳米颗粒也被连接至石墨烯及其衍生物上。因此,化学修饰的结构特点和易操作性使GO成为生物医学应用中的多功能平台。

由于许多活性化合物药物含有芳族基团,它们可以通过与石墨烯的π-π相互作用而稳定。例如,抗癌药物阿霉素(DOX),由π-π堆积加载到聚乙二醇化纳米GO(NGO)上(水平尺寸<10 nm),通过抗体官能化实现体外靶向药物递送。8

为了增强抗癌活性并靶向肿瘤组织和相关细胞,研发出一种基于多功能GO的双靶向药物递送系统。9 利用叶酸(FA)分子官能化GO实现分子靶向并用磁性氧化铁(Fe3O4 )纳米颗粒(Aldrich货号725331)实现磁性靶向。首先,制备(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APS)(Aldrich货号741442)改性的超顺磁性GO-Fe3O4纳米杂化物,接着通过APS和羧基之间的酰亚胺键将FA结合至Fe3O4纳米颗粒。在最后一步中,通过π-π堆积将DOX加载到这些多官能化载体上,如图3所示。使用异硫氰酸荧光素(FITC,Sigma货号F7250)标记。结果显示这些多功能GO-载体用于靶向递送和抗癌药物可控释放的潜力。此外,DOX的释放可以通过周围环境中的pH条件来控制。

另外,将光热疗法与抗癌药物结合可以改善治疗效果。10对载有DOX的聚乙二醇化NGO的光热疗法在临床前小鼠模型中进行体内测试。与任何单独的疗法相比,将光热疗法与化学疗法结合显著提高了癌症治疗的疗效。第二次体内测试,将DOX加载到含有分子靶向基团(FA-修饰的β-环糊精)的GO载体上。11在这两项研究中,官能化的GO药物递送系统比体内单独的DOX疗效更好且副作用更少,进而提高癌细胞的死亡率。最新的一项研究中,考察了磁靶向药物递送与光热疗法和磁共振成像(MRI)的联合使用。12

基因递送面临的一个主要挑战是研发一种安全的基因载体,既可保护DNA不被降解,又可使细胞高效地摄入DNA。最新研究表明,PEI修饰的GO不仅显著降低了PEI的细胞毒性,而且提高了转染效率,从而实现了DNA的高效递送。13,14并且在其中一项研究中,根据细胞内报道基因追踪显示,DNA可以递送至细胞核。14

多功能GO载体。经英国皇家化学学会许可转载。

图3.多功能GO载体。经英国皇家化学学会许可转载。


 表1. 石墨烯在生物科技中的应用

应用 适宜形式 优势
药物与基因递送 GO & rGO血小板
  • 优异的生物相容性,生理溶解度和稳定性
  • 可加载多种分子的能力
组织工程 石墨烯薄膜/ GO&
rGO血小板
  • 生物相容性
  • 弹性与灵活性
  • 适应性
  • 功能性
分子成像 GO & rGO血小板
  • 优异的生物相容性,生理溶解度和低细胞毒性
  • 独特的光学特性(NIR区域,降低了细胞,器官或组织的干扰)
  • 降低了来自细胞,器官或组织的干扰)
电化学生物传感器 石墨烯薄膜/rGO血小板
  • 低电荷转移电阻
  • 快速的电子转移动力学
  • 低背景噪音
  • 高信噪比
光学生物传感器
(荧光共振能量
转移,FRET)
GO血小板
  • 卓越的淬火效率,可淬灭电子供体的能力
  • 吸附ssDNA
  • 低背景噪音
  • 高信噪比
  • 防止酶促切割
  • 在活细胞和体内系统的运输能力
电生物传感器
(场效应晶体管,FET)
石墨烯薄膜
  • 低热电噪音
  • 更低的检测下限
  • 由于其双极性,能够检测带正电和带负电的物质
生物电子产品,移植物 石墨烯薄膜
  • 高电子迁移率,生物相容性,灵活性,适应性,适应性
透射电镜支持物 石墨烯薄膜
  • 原子级厚度,对比度增强,有机分子直接成像
  • 静态和动态现象的原子级可视化


石墨烯薄膜,氧化石墨烯和还原的氧化石墨烯在组织工程中的应用

组织工程依赖于对具有适宜的物理,化学和机械性能的生物相容性支架的设计。石墨烯及其衍生物本身具有的弹性,柔韧性,高表面积,适应性和功能性,使其成为有意义的支架材料。薄膜形式的GO和rGO,由于其作为表面涂层材料良好的生物相容性,无明显有害影响,且可增强某些细胞功能,如基因转染和表达,而成为哺乳动物成纤维细胞生长的合适支架。

此外,在多种石墨烯涂层平台上观察到人类干细胞的生长和增殖。16在CVD生长的单层石墨烯可转移至聚二甲基硅氧烷(PDMS)(Aldrich货号761028761036),聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET),玻璃和硅/二氧化硅(Si/SiO2)平台。无论基础平台如何,石墨烯都是一种非常有前途的生物相容性支架,可促进人类间充质干细胞(hMSCs)的增殖并加速其向骨细胞的特异性分化。图4A描绘了已经转移到硅/二氧化硅平台上的CVD石墨烯膜。由骨钙素(OCN)的特异性免疫染色指示的骨细胞形成仅发生在石墨烯膜上,而在Si / SiO 2平台上没有骨细胞形成(图4B。茜素红染色可指示由于骨结节形成而产生或缺失的钙沉积物,可用于定量检测。定量检测结果显示于图4C4D中,并比较了各种支架上钙沉积的程度。其中石墨烯薄膜上的钙沉积最多,与平台无关,甚至是在缺乏生长因子BMP-2的情况下。为了验证这些结果,对比石墨烯和BMP-2诱导骨细胞分化的效果。在缺乏石墨烯和BMP-2的情况下,茜素红染色结果阴性,未检测到骨结节形成(图4E)。当加入BMP-2后,观察到阳性染色(图4G)。即使在缺乏BMP-2的情况下,石墨烯涂覆的PET也显示出阳性染色(图4F)。当BMP-2和石墨烯同时存在的情况下也得到阳性染色(图4H)。值得注意的是,即使在没有常见生长因子的情况下,石墨烯也能加速细胞分化。因此,将石墨烯薄膜用于移植物或受损组织并不会影响其周围微环境的生理条件。16

 

石墨烯可加速骨细胞分化。

 

图4. 石墨烯可加速骨细胞分化。A)在Si / SiO2上的CVD石墨烯的光学图像,显示出石墨烯边界。B)OCN标记仅指示出石墨烯区域上的骨细胞形成。C)在缺乏BMP-2的情况下生长的细胞。 D)在BMP-2存在的情况下生长的细胞。 E-H)用茜素红染色的PET基质显示由于成骨作用引起的钙沉积。E)不含BMP-2及不含石墨烯的PET。 F)不含BMP-2但含有石墨烯的PET。G)含有BMP-2但不含石墨烯的PET。H)含有BMP-2和石墨烯的PET。比例尺100微米。经许可转载自参考文献16。2011美国化学协会版权。

 

通过CVD制备的石墨烯薄膜能够促进人神经干细胞向神经元(hNSCs)而非胶质细胞的分化。17 hNSCs粘附于石墨烯而非玻璃,主要分化为神经细胞。这些研究结果为石墨烯在神经科学和干细胞研究及再生医学等其他领域开辟新的机遇。

另一项研究测试了GO和通过CVD制备的石墨烯薄膜在干细胞(hMSCs)增殖和随后分化为特定组织中的作用。18 结果显示在成骨化学诱导剂存在时,石墨烯薄膜能够使干细胞(hMSCs)为增殖分化为成骨组织。GO促进了干细胞的脂肪形成分化。GO和石墨烯薄膜通过分子相互作用形成有效的富集支架,加速干细胞的生长和分化。18

氧化石墨烯和还原氧化石墨烯在分子成像中的应用

GO是细胞内光学成像研究的荧光标记物。聚乙二醇化的纳米GO(NGO)在可见光和红外区域内发光。8 GO的内源激发荧光使聚乙二醇化NGO的分子靶向后淋巴瘤细胞的NIR成像成为可能。在其他报道中,荧光素官能化的聚乙二醇化NGO和用罗丹明6G(荧光染料,Aldrich货号252433)标记的明胶连接rGO用于细胞成。19,20 这两种情况下,PEG和明胶接头都可防止GO和rGO淬灭结合的荧光素和罗丹明。

在人类癌细胞(MG-63,HeLa,Sigma货号86051601)中测试作为细胞内荧光探针的rGO量子点。21-23 实验材料的制备是将GO或rGO与量子点(QDs)使用牛血清白蛋白(BSA,Sigma货号A788822作为桥梁结合后通过一步溶剂热方法得到,或将PEG和FA作为分子靶向基团。23 纳米复合材料在体外和体内研究中显示可吸收近红外辐射,结合了细胞肿瘤生物成像和光热疗法的优点。上述功能的结合可以为癌症诊断,影像学和治疗带来巨大的机遇。

尽管大部分光学成像研究的报道都是在体外进行的,仍有一些体内研究的记述。将聚乙二醇化的NGO(横向尺寸10-50nm)与NIR荧光染料结合用于体内荧光成像,然后对小鼠肿瘤模型进行光热疗法。24 结果显示其高效的肿瘤被动靶向作用和在网状内皮系统中相对较低的残留。在小鼠体内未检测到明显的毒性作用。且PEG化的NGO具有非常好的生物相容性。

PEG和葡聚糖涂覆的氧化铁-GO纳米复合材料分别作为T2造影剂在体内和体外MRI研究的报道。12,25 体内研究表明PEG涂覆的氧化铁-GO纳米颗粒在肿瘤和肝脏区域积累。12肿瘤组织的大量摄取归因于肿瘤的高渗透性和长滞留作用。与单独的氧化铁纳米颗粒相比,纳米复合材料显示出更强的细胞MRI成像性能。25

正电子发射断层扫描(PET)是一种灵敏度极高的成像技术,只需少量浓缩的同位素。在小鼠乳腺癌模型中研究放射性标记的抗体偶联的聚乙二醇化NGO用于体内靶向和肿瘤脉管系统的PET成像。26 结果显示官能化的NGO可以通过靶向内皮糖蛋白,一种用于肿瘤血管生成的血管标志物(CD105,Sigma货号SRP6015)而对体内的肿瘤血管系统成像。


 石墨烯在生物传感器/生物电子产品中的应用

氧化石墨烯和还原氧化石墨烯在生物传感器中的应用

石墨烯具有独特的电化学性质包括宽电化学窗口,低电荷转移电阻,明确的氧化还原峰和快速的电子转移动力学。因此,石墨烯可作为电化学生物传感器中的电极材料。光学生物传感器所需的另一个重要特征是其官能化的能力。如前所述,石墨烯尤其是GO是可进一步官能化的多功能材料。

因为电极的前提需要电导率,基于rGO的电极已经成为电化学生物传感器研究报道的石墨烯的主要形式。由于其高表面积,它们具有高负载能力和高灵敏度。另外,石墨烯可降低生物分子的活性位点与电极区域之间的电子转移距离。因此,某种功能可能促进其与生物分子间有利的相互作用。据报道,基于rGO电极的电化学生物传感器可检测DNA,葡萄糖,乙醇,多巴胺,抗坏血酸,尿酸和对乙酰氨基酚(APAP)等多种生物分子。他们能够检测单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)中所有的四个DNA碱基。有报道表明,基于石墨烯的葡萄糖生物传感器显示出良好的灵敏度,选择性和重复性。28,29另外,使用基于rGO电极的细胞色素c,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH,Sigma货号N8535),血红蛋白(Sigma货号H7379),过氧化物(HRP)和胆固醇生物传感器已经研发。28 据我们所知,尚未有使用CVD石墨烯薄的生物传感器的报道; 然而,由于其卓越的电学性质和原子级厚度,它似乎是用作电极材料的明显选择。

在光学生物传感器中,广泛报道了使用石墨烯及其衍生物制造的荧光共振能量转移(FRET)型生物传感器。FRET是将能量从供体荧光团转移到受体荧光团。石墨烯及其衍生物在此过程中发挥某些积极作用,包括由于低背景噪音和防止酶促切割而得到的高信噪比。石墨烯和GO通过π-π堆积作用与核酸发生强烈的相互作用。单链DNA可被吸附至GO上,而双链DNA由于带负电荷的dsDNA磷酸骨架中的核碱基被屏蔽,不能被稳定吸附。通常,将连接到单链DNA上的荧光分子结合到GO上制造FRET生物传感器。根据使用的探针(如ssDNA,适体和分子信标),可以检测到不同的靶标(如cDNA,人凝血酶,Ag+,牛凝血酶,未降解mRNA和Au纳米颗粒标记的cDNA)。7将GO掺入基于MB的FRET生物传感器可提高对目标DNA的灵敏度与单碱基错配选择性。30通过引入适体作为探针,基于石墨烯的FRET生物传感器的靶向领域可以从DNA扩展到离子(Ag+),小分子和蛋白质(牛凝血酶,Sigma货号T9549)。7

石墨烯在生物电子产品中的应用

基于场效应晶体管(FET)的生物传感器具有比其他类型的电化学传感器更高的灵敏度,快速的响应,纳米级的制造规程和部件尺寸。基于FET的生物传感器主要由电学性质优异的CVD合成的石墨烯薄膜和机械剥离的石墨烯薄片制造。通过电解质门控FET检测机械剥离的石墨烯薄片无BSA标记。31 观察到pH依赖性电导,表明它们可用作pH传感器。使用CVD石墨烯制作的柔性葡萄糖FET生物传感器显示出双极性传输特性。32 在此项工作中,将石墨烯薄膜沉积在柔性PET平台上并用葡萄糖氧化酶(GOD)官能化形成溶液门控FET生物传感器(图5)。石墨烯FET可用于便携式、可穿戴式和植入式葡萄糖水平监测应用。

基于CVD石墨烯的FET生物传感器。改编自参考文献32。

图5. 基于CVD石墨烯的FET生物传感器。改编自参考文献32。

 

此外,通过CVD形成的大面积石墨烯由于其更高的电荷载流子迁移率和化学稳定性,能够更灵敏地检测放电细胞的电学活性。33在小鼠海马体培养模型中研究了CVD石墨烯薄膜与神经轴突在成熟过程中的相互作用。34石墨烯薄膜具有优异的生物相容性,并可促进神经轴突的萌发和生长。因此,石墨烯可作为应用于神经假体装置中细胞界面传感器以及记录放电生物活性的非常有前途的材料。33,35


 石墨烯薄膜在透射电镜 / 高分辨率透射电镜下的分子生物研究中的应用

透射电子显微镜(TEM)和高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)能够研究许多不同的分子。由于平台的干扰,现有的TEM支持物在观察纳米粒子,生物分子和生物材料时具有一定的局限性。超薄无定形碳膜(2-3nm厚)有助于整体电子散射并减弱低原子序数样品的对比度。36 因此通过使用由CVD形成原子级薄且高导电性的连续单层石墨烯膜可以克服上述局限(图6),且不会干扰分子的分析。基于石墨烯的膜不仅可用于原子分辨率的静态成像,而且在动态现象的原子级可视化如热激活解吸,漂移和扩散过程中也可用。石墨烯可用作有机覆盖层和附着在金纳米颗粒上的界面的超薄支持物。36 另一项研究表明,石墨烯薄片可用作TEM支持材料用于研究烟草花叶病毒(TMVs)。无需染色TMV即可获得高对比度。

Graphenea制造的CVD单层石墨烯膜

图6. Graphenea制造的CVD单层石墨烯膜(Aldrich货号773697773700773719)的高分辨率透射电镜图像。


 结论和展望

石墨烯纳米材料的多功能化学特性包括与水溶性和非水溶性活性化合物,DNA,蛋白质,细胞,靶向试剂,聚合物甚至纳米颗粒结合的能力,使其成为未来生物医学研究的理想纳米平台。GO已成为药物和基因递送,分子成像以及光学生物传感器应用中非常有潜力材料。官能化的GO是生物相容的,当与治疗试剂和靶向策略结合时,可以改善包括癌症在内的多种疾病的诊断和治疗。CVD石墨烯薄膜由于其灵活性,原子级厚度,多功能性和不寻常的特性而成为未来组织工程应用的首选材料。许多干细胞的增殖和分化表明石墨烯薄膜可能成为下一个支架材料。另外,CVD石墨烯薄膜由于其高电子迁移率和高灵敏度,非常适用于FET型生物传感器。这些薄膜也是高分辨率透射电镜下成像纳米颗粒和生物分子的理想支持物。基于rGO的电化学生物传感器性能良好。然而,在石墨烯及其衍生物可用于生物医学/生物电子应用之前,需要进行广泛的体内测试。

对于未来的展望,最新研究显示出石墨烯将光限制在极端亚波长点的独特能力。这为开发利用石墨烯等离子体的基于天线的超灵敏生物传感器开辟了可能性,其中有效探针体积为几十纳米的量级。39结合生物学和纳米电学可开发出智能神经假体装置,同时具有感应和刺激能力。CVD石墨烯薄膜与细胞的界面良好,且由于它们具有高电荷载流子迁移率和调节电荷载流子密度的潜力,作为可植入功能材料具有很好的未来。

生物技术中应用石墨烯及其衍生物的命运很难预测。但是,由于其非凡的特性,它们已经成为极具前景的多功能材料。尽管如此,此项研究的更多进展还需要多学科的融合。最终得到多功能智能材料。


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