微米和纳米技术生物材料

    

  

Phin Peng Lee, Karen E. Samy, Miquella G. Chavez, Alec Cerchiari, Tejal A. Desai*

Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California
San Francisco, San Francisco, CA 94158 USA
*Email: tejal.desai@ucsf.edu
 

 介绍

生物材料科学涉及设计和制造用于研究和指导生物学,以及仿生相关的智能材料。为了将生物材料成功整合到生物学研究中,需要对生物系统进行有意义的梳理。此外,由于我们处于材料科学和生物学的交界处,同时,后者的进步往往是由前者的突破所引发的。因此,微米和纳米技术的进步显着增强了我们对细胞和微组织的理解。因此在这里,我们讨论一些细胞和多细胞系统中生物材料的有趣进展。
 

 细胞水平上:荧光和无机探针

在细胞水平上,荧光探针是用于生物事件和信号可视化和量化的最常用工具之一。基于荧光蛋白的指示剂可以对亚细胞区室进行靶向指向,与简单的有机染料相比,其可以并入更多类型的组织和完整的生物体中。另外,荧光探针比有机染料引起的光动力学毒性更小,同时还能保持高时间和空间分辨率。许多荧光探针来自水母Aequorea Victoria(AFP),包括绿色荧光蛋白(GFP)(Roche货号11814524001),红色荧光蛋白(RFP)和青色荧光蛋白(CFP)等,以上只是略微举了一些例子。探针工程设计提供了对活细胞内多个复杂过程进行研究的工具。然而,其光致褪色速度很快,对氯离子波动和pH具有高灵敏度,从而推动了更稳定的AFP变体的开发。1 珊瑚绿色荧光蛋白(CGFP)就是一个例子,尽管它没有明亮、广泛的发射峰和激发峰,但其对pH的抵抗性非常高,因此非常适合用于标记酸性细胞器。AFP作为基于荧光共振能量转移(荧光共振能量转移)(FRET)的指示剂特别有价值。当两个荧光团相互接近(80Å),并且供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠时,会发生FRET。受体与供体荧光的比值可以作为测量细胞中生物化学事件的读数。通过对荧光探针不断进行改进,可以为活细胞的生物学提供新观点。例如,新一代高灵敏度近红外荧光探针可能能够检测到蛋白质中微小的构象变化,从而提高AFP检测报告的检测限和适用性。2另外,单细胞和单分子成像可以阐明细胞-细胞之间的不同,实现单分子相互作用的可视化,这对现有技术来说都是具有挑战性的。

作为荧光探针的替代品,人们可以通过改变反应时间和溶剂,以不同的尺寸、形状和产量来合成无机纳米粒子,如金纳米粒子、氧化铁纳米粒子和量子点(QDs)。合成无机纳米粒子的方法包括微乳液、热解、水热和溶剂热合成。3总的来说,这些粒子已被用于各种生物医学应用,包括荧光和磁共振成像、细胞靶向和药物递送。3 在一项关于肠吸收的研究中,Simovic等人对由疏水性磷脂核和PEG亲水性冠组成的纳米颗粒的物理化学性质和体内药物递送能力进行了表征(图1)。这些PEG化磷脂纳米粒子可以溶解并保留不溶于水的抗癌药物,同时将粒径分布保持在无药颗粒水平上。4 特别值得注意的是QDs,其最近已经渗透到细胞和分子生物学方法中。其由半导体核(Cd或Se)和壳(ZnS)组成,QD的光学特性比有机荧光染料强很多。量子点核的尺寸可调,可产生各种窄发射峰和宽激发光谱。这些特性使得量子点成为了单分子追踪(SPT)、荧光复合和FRET的理想选择。在SPT中使用量子点甚至带来了对细胞表面受体动力学的新发现。例如,使用荧光显微镜技术,水稳定量子点已被用于跟踪受体介导的活细胞内吞运动事件中。5然而,使用量子点作为FRET供体仍然是一项新兴技术。如能实现生成更亮、更小的量子点,那么就有望开发SPT和FRET联合技术,在膜受体动力学、活化和运输领域带来革新。5

图1.  PEG纳米颗粒的透射电子显微图(TEM)图像(A)。通过带通滤波(B)实现更高的分辨率。二硫化物切割的PEG2000-SS- Biotin纳米颗粒不会因添加avidin-FITC(C)而发荧光。然而,完整的PEG2000-SSBiotin颗粒可以结合avidin-FITC并通过荧光显微镜观察到(D)。根据参考文献3修改并获得许可。

 

 细胞水平上:细胞相互作用

除了成像之外,智能材料和传感器的发展也有助于研究细胞与环境之间的物理力。通过对涉及细胞-细胞和细胞-基质相互作用的力进行量化,可以对外部-内部物理线索的反馈,以及它们在影响细胞行为中的作用有更深的理解。最初,Harris等人开发了一种在软硅胶基质上培养细胞的系统,以研究细胞运动及其在周围基质上的相关作用力。6 软基质允许细胞施加在硅树脂上的任何力都可以以基材表面上的皱纹形式可见。使用微针和配重组合来重新产生这些皱纹,就可以计算出施加在这些表面上的剪切力。6

现在研究细胞力量的技术要复杂得多。目前存在各种形式的力显微镜,可以对细胞施加的力进行更加定量的测量,无论是彼此之间的力,还是其在周围基质上的力均不例外。牵引力显微镜(TFM)是Harris等人开发的系统的演变。TFM的进展,例如分析两维以上的能力,不仅能够研究基板平面上的传统剪切牵引力,还开辟了研究细胞间施加的向内力的可能性。7如图2所示,Legant等人开发了一种使用TFM在三维(3D)基质内测量细胞施加的力的系统。7 简而言之,将表达GFP的细胞封装PEG水凝胶(机械性质已知)内,每个细胞附近都有荧光珠。通过跟踪周围基质内珠子的位移,采用线性弹性理论和有限元方法可计算细胞牵引力。7 这种强大的工具使得我们可以在时间和空间两个方面对细胞 - 基质相互作用进行量化,开辟了多种各种细胞类型,细胞-配体相互作用研究,甚至多细胞相互作用未来研究的可能性。

Legant等人开发了一种使用TFM在三维(3D)基质内测量细胞施加的力的系统。

图2. A)三维水凝胶中细胞施加牵引力大小的等高线图。B)以珠子的位移轨迹所示的细胞表面网格。比例尺表示50μm。根据参考文献6修改后获得许可。

细胞粘附力显微镜(CAFM)是另一种用于研究细胞-基质相互作用的方法。其最初的设计可以用于测量从表面去除无生命物体所需的力,随后通过改进可以用于研究细胞 - 基底粘附力。该系统由Sagvolden等人开发,使用倾斜原子力显微镜(AFM)悬臂梁和激光偏转来测量移动粘附在基板上的细胞所需的力。8 与倒置显微镜相结合,CAFM可以生成与去除附着的细胞相关的力学曲线。该系统消除了构建凝胶-珠系统的必要性,同时易于与典型的二维(2D)细胞培养装置相结合。然而,CAFM无法提供优秀的TFM时空分辨率和3D测量。

毫不奇怪,研究细胞力学的许多技术都来自其他研究领域。例如,最初在物理学领域开发的,用于检测微米尺寸颗粒上力的光学镊子已经适用于研究细胞力学。具体而言,可以使用光学镊子和微珠来研究细胞外基质的机械性质对细胞表面蛋白质的影响。Choquet等人首先应用光学镊子来操纵配体包覆的乳胶微珠,以研究它们与鼠成纤维细胞的相互作用。9 该装置可以追踪细胞力下单个微珠的移动,来精确测量从粘附细胞上分离珠子所需的力。9 Wang等人还使用了具有磁性扭转细胞计量术的微珠来研究细胞-配体相互作用。利用配体包覆的铁磁微珠来研究不同的机械载荷对特定整合素的影响。10 在该系统中,使用强磁场代替光镊,施加到铁磁微珠上。同时正交添加第二个较弱的磁场以扭转微珠。10 这样,与光镊相比,其可以以较高的处理量实现一组细胞上机械负载的研究。因此,该系统有可能研究多细胞相互作用。

除了微珠操作之外,微米垫还可以深入了解细胞与其环境之间的相互作用。 Galbraith等人建立了一个测力装置,该装置由粘贴在悬臂上,由涂覆有层黏连蛋白、微米尺寸的垫组成(图3)。该装置测量了这些垫对成纤维细胞所产生的力的位移响应。再加上悬臂的已知机械特性,从而可以精确量化细胞产生的力。11

Galbraith等人建立了一个测力装置,该装置由粘贴在悬臂上,由涂覆有层黏连蛋白、微米尺寸的垫组成

图3. A)附着在微机械装置中悬臂上的微米垫,用于研究细胞牵引力。比例尺表示10μm。B)说明计算细胞产生牵引力的力学图。根据参考文献4修改并获得许可。

使用微结构来理解细胞相互作用并不局限于物理力的研究。如图4所示,Pinney等人证明微米棒和微米镜可以影响心脏细胞的纤维化反应。12 通过修饰与细胞相互作用的微环境,可以在不施用药物的情况下实现治疗反应。12 类似地,纳米管涂层可以增强内皮愈合,同时降低平滑肌细胞增殖。13 这些关于细胞与微观和纳米结构相互作用的研究为了解物理环境对细胞功能的影响提供了新视野。

Pinney等人证明微米棒和微米镜可以影响心脏细胞的纤维化反应

图4. A)微米棒和B)由聚合聚乙二醇二甲基丙烯酸酯制造的微米镜。荧光染色的鼠心脏成纤维细胞与微米棒(C)和微米镜(D)相互作用。比例尺= 50μm。根据参考文献11改编,并获得许可。

对先进材料和技术的巧妙运用推动了我们对细胞相互作用的理解。随着我们不断开发纳米级及以上级别的方法学,解答复杂生物问题的机会将继续增长。

 

 微组织水平:表征

对细胞组织间的相互作用进行精确表征于支持组织工程的发展而言是必要的。生物传感器在细胞水平上对生物学表征进行了重大推进,其灵敏度和分辨率已被创造性地应用于研究多细胞构建体的复杂性。例如,荧光探针也适用于多细胞构建体中细胞表型或生物化学信号事件的特定表征,因为它们需要在最大程度上减少对组织或3D构建体的破坏。一个例子是研究多细胞球体中心的细胞死亡 - 一种用于研究多细胞微组织的重要体外模型。 Wartenberg等人使用共聚焦激光扫描显微镜来确定多细胞神经胶质瘤球状体中的细胞活性。14 尽管荧光染料的扩散、光散射和吸收存在明显的局限性,并且数据容易被过度解释,但荧光探针仍然是表征多细胞构建几何形状和活力,同时不扰乱细胞或微环境结构的最佳方法。

无机微米和纳米粒子也在组织水平传感和成像中展示出了多功能性和实用性。具有脂质双分子层的二氧化硅纳米粒子已被用于改善各种生物传感应用中荧光染料的功能。15 通常,脂质体在二氧化硅微球的存在下会发生破裂,在微球周围融合并形成脂质双分子层涂层。使用多孔二氧化硅微球体,可将荧光团纳入内部孔隙空间(图5)。研究表明,具有支撑脂质双分子层的微球可以保护pH敏感染料,在周围介质中存在更高pH值的情况下保持荧光强度。15 另一方面,相比于大多数有机分子染料,金纳米粒子可以表现出更高的吸收和散射强度。16 这些优势以及它们的尺寸依赖光学和光热性能使得金纳米颗粒成为了适合体内成像的造影剂。金纳米颗粒,以及金纳米壳、纳米笼和纳米棒,可以吸收近红外(NIR)光,此类光可以穿透人体组织深达几厘米。吸收近红外光后,金纳米颗粒可以将热量释放到周围组织,从而用于激发成像、癌症治疗和肿瘤消融应用。16

使用多孔二氧化硅微球体,可将荧光团纳入内部孔隙空间

图5.A)附有双层脂质体涂层的固体(左)或多孔(右)二氧化硅微球的示意图。B)多孔二氧化硅微球的使用实例。通过掺入α溶血素,在双层脂质体内形成孔,从而改变内部pH值,对pH敏感染料进行活化。C)无孔微球(左)和多孔微球(右)的扫描电子显微镜图像。多孔微球的高分辨率可以细化多孔表面。根据参考文献14改编,并获得许可。

值得强调的是无机颗粒在组织工程中的应用。Saldanha等人使用氧化铁颗粒来标记和追踪间充质干细胞(MSC),使用磁共振成像(MRI)来监测关节软骨再生17。在移植前用超顺磁性氧化铁标记MSC可促进移植细胞群的纵贯性非侵入性体内生物分布评估(图6B)。该研究的结果明确显示了:存在多种需要开发技术来监测基于细胞的组织工程策略的应用。

 

 微组织水平:生物传感器

除了表征微组织之外,微米和纳米技术也正在积极地用于生物传感器的开发。有机颗粒和分子可以通过专门设计用作生物传感器,作为检测酶或抗体活性的识别元件,或作为其他识别元件的递送支架。与荧光团、量子点或纳米颗粒结合的肽或蛋白质已被用于检测HIV抗体、细菌成分和疾病状态下的分子,例如癌症中的EGFR和阿尔茨海默病患者的淀粉样斑块。18 聚合物基颗粒通常被开发成球形,作为生物传感器应用胶囊。有一种常见的聚合物:聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物(PLGA)可以通过双重乳液法形成纳米颗粒,包裹亲水性或疏水性内含物。 Nehilla等人合成了QD和载药PLGA纳米粒子,用于增强成像和药物释放应用(图6A)。19

微组织水平:生物传感器

图6. A)在MSC系中摄取荧光标记的微米级氧化铁颗粒。左图:将标记颗粒内化至相同细胞的MSC细胞质(左上)、成功的MRI(2D梯度回波)对比成像(左下)。右图:未标记的MSC显示无荧光(右上)或对比成像(右下)。比例尺=10μm。根据参考文献16进行改编,并获得许可。 B)加入到神经元细胞系(PC12)组织培养物中的QD-负载PLGA纳米颗粒。使用CellTracker Green标记PC12细胞,而纳米颗粒显示为红色。根据参考文献18进行修改并获得许可。C)ssDNA生物传感器应用的示意图。C1:设计用于检测DNA的分子信标(左)或酶凝血酶(右)。C2:新型蛋白质亚基(左)或新型多细胞聚集体(右)的DNA导向装配。摘自参考文献20,21,23,已获得许可。

除了作为基于纳米颗粒的载体应用之外,聚合物本身还可以通过设计用作生物传感器。常见的刺激响应聚合物包括pNIPAM、20 pHEMA、21和pVA-pAa。22 这些聚合物可以掺入到水凝胶、聚合物刷和分子印迹聚合物涂层中,以检测细胞(DNA、FRET、抗体片段)或多细胞(pH、葡萄糖和氧)水平。23 寡核苷酸也可以作为生物传感器的平台。通常,单链DNA(ssDNA)可以通过物理吸附、化学交联或共价连接固定到如玻璃、聚合物或金纳米粒子一类的表面上。 DNA的磷酸基团可用于检测带正电荷的分析物或染料分子(图6C)。24 此外,DNA链可形成二级结构,作为分子信标来检测DNA、小分子和蛋白质,用于抗体检测和信号放大(图6C,左图)。24 最后,ssDNA及其互补对应物可用于新型抗体25和多细胞组织26的DNA指导装配,这又可用在生物感应和组织表征的进一步研究中(图6C ,右图)27

 

 结论

对于生物学家和工程师来说,微米和纳米技术是体外研究细胞和组织的有用工具。然而,随着人们越来越多地认识到:用于研究生物系统的生物材料的物理化学特性可能影响系统本身的结构和功能性能,了解使用这些材料时的限制和注意事项变得愈发重要起来。例如,在多细胞水平上,用于在体外容纳和监测组织的平台可能引发诸如组织反转和生物学性能损害等现象。28 人们尚未完全了解这些现象是如何发生的,以及发生的机制,但是有一件事情是肯定的:如果材料科学和生物学能够不断在相互依存的情况下取得持续推进,会得到很多启发性的答案,产生更多极富吸引力的问题。
 

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