用于药物递送和其他生物医学应用的聚(氨基酸)嵌段共聚物

Carmen Scholz
Department of Chemistry, University of Alabama in Huntsville Huntsville, AL 35899
Email: scholzc@uah.edu


 PAA介绍:蛋白质最好的替代品

人类在整个存续进程中都在利用蛋白质材料,从最初使用羊毛和丝绸等材料来保温和保护自己,到使用重组DNA技术合成具有独特和有用性质的蛋白质。蛋白质由基因序列设定的氨基酸连接组成。天然存在的蛋白质包含20种氨基酸。它们通常被称为标准蛋白质氨基酸,这些结构单元的序列形成蛋白质的基础功能。蛋白质的特定功能影响特定氨基酸的序列和丰度。例如,蚕茧中丝蛋白的主要天然功能是保护蚕蛹。由此,非常疏水的和化学非反应性的甘氨酸和丙氨酸占丝蛋白中氨基酸的70%。但酶是具有显著不同功能的蛋白质,因此它们由不同的氨基酸组成。酶实现生化催化功能,其氨基酸序列通过形成催化袋和分子结构实现催化活性。独特的三级结构维持酶的稳定性,并通过形成三维结构外部的官能化氨基酸来保证酶在(含水)介质中的溶解度。

蛋白质独特和高度靶向的生物功能使其成为药物递送系统的理想候选,因为蛋白质能够:

  • 为多种治疗药物形成理想的“摇篮”,包括精巧的亲水性蛋白质或疏水性小分子。

  • 互作、折叠和运输DNA

  •  利用特定位点的互作向目标位点药物递送,利用跨膜转运机制,将治疗有效载荷递送至特定的作用位点,无副作用。

然而,我们设计蛋白质结构的能力以及理解其互作的可能性仍处于起步阶段。以我们目前所了解的蛋白质组学的复杂性,仍然无法解决大量合成无缺陷(即序列正确)蛋白质的问题。

由于不能合成特定药物递送蛋白质的限制,研究人员转而研究“最好的替代品”:聚(氨基酸)(PAA)。虽然这类聚合物有时也被称为“多肽”,但本文作者认为使用该术语有误导性,因为“肽”是指具有特定氨基酸序列的聚合物结构。然而,本文中的大分子通常只有两种或三种不同的氨基酸合成,且没有特定的氨基酸序列。

PAA同蛋白质(和肽)类似,由酰胺键连接的氨基酸结构单元组成。这种主链结构和由天然存在的L-氨基酸合成确保了它们的生物相容性。因此它们的降解产物是L-氨基酸,且易被身体吸收。大多数PAA由两种以内不同的氨基酸连接构成无规或嵌段共聚物。

当使用L-氨基酸合成PAA时,聚合物保持单体的立构规整性。因此产生全同立构PAA聚合物。这种结构非常重要,因为立体规则性是形成不同的二级结构的原因。通常,螺旋被认为是全同立构聚合物的二级结构。所得到的PAA共聚物还表现出L-氨基酸结构单元的化学特性,如极性、静电和溶解性行为。这些物理特性被用于合成两亲嵌段共聚物。两亲嵌段共聚物易于自组装成凝胶、胶束、膜、囊泡、纳米粒子、纳米凝胶和其他三维结构。本文讨论了PAA嵌段共聚物的合成与应用。


 PAA的合成

PAA及其合成方法已由Kricheldorf详细论述。1 如图1所示,PAA通常由氨基封端的试剂引发的氨基酸N-羧酸酐(NCAs)的开环聚合反应合成。结果表明此聚合反应遵循活性开环聚合。利用这种聚合技术可以合成PAA嵌段共聚物及无规共聚物,具有很高的通用性。如果将氨基酸NCA连续加入引发剂(先加入氨基酸A的NCA,后加入氨基酸B的NCA),则形成AB嵌段共聚物。如果两种氨基酸的NCA作为混合物加入引发剂中,则形成无规共聚物。由聚合活性可以得到不同复杂性的其他聚合物结构。

合成PAA嵌段共聚物和PAA无规共聚物的N-羧酸酐聚合示意图。

图1.合成PAA嵌段共聚物和PAA无规共聚物的N-羧酸酐聚合示意图。

 

合成用于药物递送和生物医学应用的PAA时,将分子量严格控制在狭小的范围内是至关重要。可采用活性聚合技术生产嵌段共聚物来达到目的。为此,Hadjichristidis等采用高真空技术纯化单体,溶剂和引发剂。并在绝对无水的专用容器中进行聚合。2Deming 等发现使用过渡金属催化剂对合成的PAA的分子量和多分散性进行控制。我们的研究表明,最初的几个加成反应(即将前几个氨基酸结构单元添加到引发剂)对于控制反应和生产特定要求分子量和多分散性的PAA来说最重要。3 聚合开始时,新生寡聚物还不足以形成螺旋结构,但由于氢键互作倾向形成β-折叠。这些刚性结构抑制了生长链继续对N-羧酸酐单体进行亲核攻击的能力,并且这些小β-折叠结构具有从聚合溶液中沉淀出来的倾向,有效地阻止了聚合。5 若β-折叠的形成没有得到控制,则最终产物由几个链长度超过预期的长链组成,由单体决定:引发剂比例和低分子量寡聚物。

尿素可以有效地抑制新生PAA链之间氢键的形成。并抑制产品的过早沉淀。这有助于聚合遵循活性机制。4 由于尿素对β-折叠形成的抑制,氨基酸链有足够的时间达到约10个重复单元的长度,从而能够形成α-螺旋。一旦克服了β-折叠阶段,聚合就以可控的方式进行,其中链端仍保持反应性(活性)且嵌段共聚物易形成(图1)。


 聚(氨基酸)嵌段共聚物:药物递送系统原理

氨基酸具有多种化学性质,可根据其侧链的性质进行细分,包括脂肪族,芳香族,含硫及含有可离子化基团。当设计用于药物递送的PAA时,根据药物和溶剂环境需要选择化学性质符合的氨基酸。通常,两亲性嵌段共聚物由亲水性(可电离)和疏水性氨基酸组成(图1)。接触选择性溶剂中时,这种两亲性将诱导嵌段共聚物自组装。6 在药物递送的情况下,当聚合物暴露于含水环境时,嵌段共聚物的亲水性片段自组装成的外层或冠状结构,而疏水性片段形成紧密堆积的结构作为疏水性药物的“货舱”(图2A)。

Deming等研究了PAA二嵌段和三嵌段共聚物的自组装和填充,并提出了一个很好的模型来说明聚合物互作及随后的自组装(图2)。7 具体地说,他们研究了由poly(l-Leu),一种疏水性氨基酸和poly(l-Lys),一种可离子化的氨基酸组成的共聚物。制备具有以下通用结构的聚合物p(l-Lys)-block-p(l-Leu)和三嵌段共聚物p(l-Lys)-blockp(l-Leu)-block-p(l-Lys),且各个嵌段的长度各不相同。所得嵌段共聚物具有带正电荷的聚p(l-Lys)嵌段,有助于其在水中的溶解性并形成扭曲(拉伸)的无规卷曲。当暴露于含水环境时,疏水性p(l-Leu)嵌段形成二级结构的α-螺旋。三嵌段共聚物则存在两个与p(l-Leu)嵌段相邻的p(l-Lys)嵌段。

当用作药物递送载体时,两亲性二嵌段共聚物在暴露于选择性溶剂如水中时通常自组装成典型的球状聚合物胶束(图2A)。大多数情况下,疏水片段紧密堆积避免与水接触,而亲水片段溶于水并在疏水核心周围形成壳或冠。但p(l-Lys)-block-p(l-Leu)二嵌段共聚物中非常稳定的p(l-Leu)螺旋结构组装形成棒状,阻碍其形成球状填充结构而扁平层状填充(图2B)占主导地位。这些棒状平行排列并通过疏水性分子间互作保持结构。然而,链长增加的亲水性嵌段呈现拉伸的无规卷曲构型并增加了摩尔体积。且带正电的聚p(l-Lys)链之间的静电排斥使得情况更加不利。随着亲水性嵌段的链长增加,进而形成弯曲的膜。这是亲水嵌段不对称堆积的结果(图2C)。由此产生的冠状体积增加在能量上有利。在两个方向上具有曲率的结构可以形成聚合巨型单层囊泡。 聚(L-赖氨酸)嵌段之间的排斥效应也可以通过将p(l-Leu)嵌段的平面扭曲成原纤维来解决(图2D)。尽管p(l-Leu)嵌段的螺旋保持平行填充,但亲水嵌段通过在生长的原纤维周围朝一个方向扩张增加体积。

PAA二嵌段和三嵌段共聚物自组装

图2. PAA二嵌段和三嵌段共聚物自组装成(A)球状胶束; (B)扁平膜; (C)曲膜;(D)原纤维,其横截面延伸出纸平面,插入物显示螺旋如何组装成扭曲的纤维。经Ref许可转载,72004美国化学协会版权所有。

 

(l-Lys)-block-p(l-Leu)-block-p(l-Lys)三嵌段共聚物的两个亲水嵌段共价连接至疏水核心,不会形成弯曲结构(图2C)。相反,p(l-Lys)嵌段无法不对称填充并易形成原纤维。弯曲和纤维结构模型均可用于解释在p(l-Lys)-block-p(l-Leu)和p(l-Lys)-block-p(l-Leu)-block-p(l-Lys)嵌段共聚物中观察到的凝胶化行为。8 由于它们的两亲性质,这些共聚物体系可以装载疏水性(核心)以及亲水性(冠中)药物。

通过使用大分子引发剂启动氨基酸NCAs的开环聚合,我们可以深化上述基于PAA的药物递送系统的概念。PEG是研究最透彻的生物相容性聚合物之一。PEG具有极大的排阻体积,对其附属结构表现出“隐形特性”。使其结构对邻近的蛋白质分子“不可见”。 PEG对于降低蛋白质互作的有效性用物理化学术语解释是由于其在水中的低界面自由能及与水分子的独特配位作用,每个PEG重复单元与两至三个水分子配位。PEG化的PAA结构被用作药物递送系统,使用聚合物胶束或含PEG的纳米粒子形成冠。它们还被用于与含蛋白质(身体)液体接触的植入式设备的生物相容性表面。药物递送系统中PEG化可防止网状内皮系统的摄取药物,且PEG包被的表面可有效抑制生物污染。

PEG化PAA的合成遵循图1所示方案,其中R代表NH2封端的PEG。生物医学应用中通常使用分子量在2,000至10,000 Da的PEG来确保降解产物的肾清除。也可使用双功能α,ω-diamino PEG作为大分子引发剂。所得的嵌段共聚物在中间具有PEG嵌段,可形成有趣的自组装分子结构,如花状胶束。

PEG化PAA表面修饰。

图3. PEG化PAA表面修饰。A)PAA链与表面的多点连接(如通过l-Cys(黄色)和金表面之间形成共价键)与PEG-嵌段(蓝色)远离表面延伸表达隐形特性。B)通过单点附着氨基酸寡聚物和其后的PAA聚合物胶束修饰。X表示反应性末端侧基,如l-Lys中的氨基。PAA寡聚物和PAA聚合物胶束之间形成共价键。

 

PEG化的PAA可直接附着于表面,并用于药物递送。含(l-Cys)重复单元的PEG化PAA的附着可通过覆金表面来实现。10 为此,l-Cys NCA通常与另一种氨基酸(图3A中以绿色显示)共聚,如l-Lys NCA或l-Glu NCA,以实现反应性半胱氨酸残基的最佳间隔(稀释)。l-Cys重复单元瞬时与黄金表面反应。每个嵌段共聚物链中的重复l-Cys单元形成表面的多个锚定点(图3A)。

由于PAA嵌段的多价锚作用,当暴露于含水环境中时,PEG嵌段可自由延伸远离表面。该体系结构达到两个目地:1)PEG通过多个共价巯基 - 金键连接稳固地附着于表面,且2)PAA嵌段仍与表面紧密结合。这两个因素通过掩蔽各个PEG链之间可能形成的“孔”而有助于表面的整体生物相容性。众所周知,使用“移植”方法难以在表面上形成致密聚合物刷子。这是因为已经连接的链形成的浓度梯度对额外的移植造成强烈的动力学阻碍。此外,PEG在含水环境中极大的排除体积虽然有利于防止蛋白质互作,但更阻碍了“移植”步骤中密集PEG刷子的形成。图4显示用PEG-block-p(l-Glu)110-block-p(l-Cys)10和PEG-block-poly((l-Glu)110-co-(l-Cys)10)在金表面完全涂覆。无论PAA无规共聚物或嵌段共聚物的聚合物结构对表面的聚合物形态几乎没有影响。涂层均匀且无针孔。

涂覆金表面的10×10μmAFM相图像

图4.用PEG-b-p(l-Glu)110-blockp(L-Cys)10(A)和PEG-block-p((l-Glu)110-co-(l-Cys)10(B)涂覆的金表面10×10 μm AFM键合相图(B)。

 

图3B示意描述了另一个结合表面涂层和表面装饰并用于装载药物的基于PAA的聚合物胶束概念。图示,oligo-(l-Lys)通过末端巯基共价连接到金表面,这是由于在l-Lys NCA的开环聚合中使用半胱胺作为引发剂的结果。随后,该表面用PEG化PAAs (HOOC-CH2-PEG114-block-poly(Bz-l-Glu)13)制备的胶束装饰,上述胶束在冠部携带羧基而与p(l-Lys)反应。11 poly(Bz-l-Glu)侧链中的末端羧基变为苄基酯以实现胶束化的两亲性。胶束核心中苄基的强疏水互作维持胶束形态。聚合物胶束的末端羧基与poly(l-Lys)的氨基官能团之间形成的酰胺键将胶束共价连接到poly(l-Lys),如图5所示。

涂有硫醇封端的金表面的10×10μmAFM相图像

图5.用硫醇封端的p(l-Lys)15涂覆且用HOOC-CH2-PEG114-block-p(Bz-l-Glu)13形成的聚合物胶束装饰的黄金表面的10×10微米原子力显微镜相图。

 


 总结

本文讨论了用于药物递送的PAA嵌段共聚物的合成及表面修饰在生物医学产品中的应用。为此检验了多种自组装结构,包括球状聚合物胶束和可形成凝胶的膜。结果显示氨基封端的PEG可用作PAA合成中的大分子引发剂,产生嵌段共聚物。PEG化PAA也可自组装成聚合物胶束。此外,若PAA片段含可与表面反应的氨基酸(如L-半胱氨酸与金瞬时反应),则PAA嵌段可用作将PEG以共价键“移植”到表面的多锚点。另一种表面修饰方法中,共价连接到表面的PAA寡聚物可进一步用PAA聚合物胶束装饰,使得药物递送系统能够附着到表面。


 参考文献

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  3. Deming, T.J., JACS 1997119 (11), 2759–2760.
  4. Ulkoski, D.; Armstrong, T.; Scholz, C. “Investigating the Secondary Structure of Poly(amino acids)” in: Tailored Polymer Architectures for Pharmaceutical and Biomedical Applications (ed. C. Scholz, J. Kressler) ACS Symposium Series 1135 2013, pp 69–85.
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