可用于再生医学和组织工程的定制胶原基质

    

Jiayu Leong,1 Liam Grover,2 Hyunjoon Kong1*
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering
University of Illinois, Urbana-Champaign, IL 61801 USA
2University of Birmingham, UK
*Email: hjkong06@illinois.edu


 简介

胶原在组织结构,组织强度和细胞基质(比如像不溶性配体调节多种细胞表现型活性)中都有着重要作用。无论是从动物组织中分离得到,还是通过重组技术获得,胶原都具有酶介导生物降解性和细胞粘附性,这使得它成为了基础和应用生命科学所用基质的潜在构建物。另外,有研究表明,胶原不容易引起抗原性,因此它也可用于长期的体内细胞移植治疗,比如组织再生。人们运用一系列化学偶联和物理连接的手段,调整胶原的生物分子,化学和机械特性,使它在组织工程胶原材料中的表现更佳。比如,凝胶和微孔基质形式的胶原材料经过化学修饰,携带上具有生物活性的分子,调节目的细胞的表现型活性和分泌活性。另外,胶原材料的微结构经过化学和物理改造,调节了它的机械和运输特性。经过这些努力和改造,三维(3D)胶原支架有了巨大的发展,可用作功能性材料,有助于体内体外组织修复应用。本文将介绍一系列最新的胶原基质改造的化学修饰和方法,获得的胶原材料提升了再生医学对于各种组织缺陷治疗的有效性。


 提取胶原差异

胶原是由一大类三螺旋蛋白组成,在脊椎动物中是最丰富的蛋白族群,约占总蛋白的30%。一般来说,一个胶原多肽链是由大量重复氨基酸序列组装成,大多数是甘氨酸-X-Y,其中X是脯氨酸,Y是羟脯氨酸。I型胶原在人体中含量最丰富,每条链包含有31-38个赖氨酸残基。1 有趣的是,人、大鼠、小鼠和牛类的胶原分子赖氨酸数量和位置都高度保守。不同物种间微小的氨基酸组成差异催生了医学应用,包括美容真皮填充物和伤口愈合敷料的模拟临床抗原测试。不同种类胶原蛋白的一个重要差异来源是赖氨酸修饰形成羟基赖氨酸。脯氨酸和赖氨酸的羟基化对于胶原原纤维形成和基质矿物化都有重要影响。2  在体内不同的羟基化方式对于各部位结缔组织特性的形成至关重要,羟基化的不同也会影响用于组织工程的支架的结构和化学特性。因此,识别出天然胶原材料的来源和化学特性对于胶原材料能否在可再生工程中被可靠使用就非常重要了。


 胶原重组合成

为了避免天然胶原材料差异所导致的特性和功能影响,利用重组技术生产出的特性统一的胶原正被越来越多地使用。我们通过编码胶原分子的基因转染哺乳动物细胞,昆虫细胞,酵母,或者是Escherichia coli来生产重组胶原分子。重组胶原能够自组装成有序的纤维结构,这种结构与天然胶原的类似。3 比如,交联重组人胶原III型(酵母Pichia pastoris产生)凝胶展现出和人体角膜基质相似的葡萄糖扩散系数。4

重组技术还被用来引入非天然半胱氨酸,以便实现巯基化学生物偶联。这一点在胶原工程中非常有用,因为自然情况下,半胱氨酸不会出现在天然胶原的三螺旋区域。重组人体胶原蛋白在每个生物高聚物的指定位置有2,4,或8个非天然半胱氨酸,扩展了胶原改造的可能性,使得胶原分子能够通过巯基化学形成凝胶和固定生物活性因子。需要指出的是,包含有非天然半胱氨酸的胶原变体比天然的三螺旋结构更稳定,能够支持细胞粘附。


 胶原材料偶联生物分子

胶原分子被设计形成多孔支架,胶,纤维和薄膜用来引导细胞在坏损组织中进行重建。另外,胶原还可以用来在基质中包裹改造细胞,并在受伤移植部位刺激再生功能。支架的生化组成和机械特性不仅会影响被包裹细胞的活性和表型,还会影响聚集的细胞群的功能和结构特性。基质材料的特性可以通过各种手段进行调整修饰,以便应用于特定的治疗。比如,固定的生长因子可以用来提供增强细胞粘附和功能组织生长的生物活性信号。另外,基质强度也可以被控制,引导细胞履行不同功能。

有许多化学手段可以将胶原与感兴趣的分子进行偶联。胶原赖氨酸上的初级ε氨基基团与含有异硫氰酸酯,异氰酸酯,N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS),五氟酯,醛,或活性羧基基团的化合物都能发生反应。因为残留的副产品和未反应完的交联剂都能内化并和细胞中其他蛋白发生反应,所以选择没有潜在毒性的试剂就很重要。比如,戊二醛(Sigma-Aldrich货号3802)是一种强羧基化试剂,能够通过胺甲基化反应或者是还原性氨基化反应缩合氨基。但是,如果没有纯化彻底,没有反应完的戊二醛具有毒性,能引起细胞和组织中的蛋白交联。6,7

NHS酯常被用来实现胶原分子氨基基团生物分子特殊功能化修饰(方案1A)。一系列商业化的蛋白质标记NHS-功能化生物分子探针已经推出。相反地,天冬氨酸和谷氨酸常被用作锚定基团与氨基功能化生物分子反应。为了改善活性,碳二亚胺,比如 1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(Aldrich货号39391)经常与水溶性 N-羟基硫代琥珀酰亚胺共用(Aldrich货号 56485)来激活羧酸基团(方案1B)。比如 Hosseinkhani et al.利用含有异亮氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)层粘连蛋白模仿五肽抗原决定簇化学修饰胶原。与胶原未被修饰的基质相比,IKVAV-偶联胶原基质能够显著提高体外神经网络的背根神经节细胞功能.8 。另外,EDC/NHS酯化学能够偶联折叠蛋白形成胶原,同时又保留了原蛋白构型和生物活性。比如,信号蛋白,血管内皮生长因子(VEGF),通过EDC/NHS酯化学反应固定在胶原基质上,与溶液中的VEGF相比,能更有效增强基质培养内皮细胞的活性。9

另外,Traut试剂,也叫作2-亚氨基硫烷盐酸盐(Sigma货号 16256)是一种小硫醇化化合物,能与初级氨基反应,引入小间隔臂,这些间隔臂末端有自由氢硫基。

通过偶联方法功能化胶原

方案1通过偶联方法功能化胶原A)NUS-功能化生物分子;B)氨基功能化生物分子;C)Traut试剂引入氢硫基团或D)马来酰亚胺功能化生物分子。

 

方案1C)使用这些试剂,含有巯基的生物分子能够通过形成可逆二硫键连接到胶原上,而含有马来酰亚胺的生物分子能够通过稳定的巯酯键连接上去。马来酰亚胺能够通过sulfo-SMCC(琥珀酰亚氨基丙酸-4(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)(Sigma货号M6035)(方案1D)加入多肽或蛋白质中。为了诱导本体或移植间质干细胞成骨分化,增强骨骼组织再生,需要加入骨形成蛋白2(BMP2)。为了能够有控制地释放BMP2,sulfo-SMCC修饰的聚组氨酸抗体通过Traut试剂偶联到胶原基质上。10 因为有更多的聚组氨酸抗体通过化学偶联而不是物理吸收的方式交联到胶原上,所以胶原系统就能在较长的时间内逐步释放聚组氨酸目标BMP2。结果就是改造过的胶原基质促进了活性和功能性成骨细胞的生长。

这一方法还被用来同时进行含巯基生物分子固定和诱导胶原纤维偶联,以此减少胶原降解率。11 实验表明,氢硫基团内交联能够降低胶原基质的降解并且适度增强血管再生。另外,血管再生又被二硫键固定的VEGF进一步增强,因为支架上一直存在着VEGF蛋白。

为了获得更大的空间控制力,可以使用二苯甲酮-4-异硫氰酸酯和放射的方式将生物分子以特定的微形式固定到胶原基质上。12,13 通过UV激发,二苯甲酮形成瞬态双自由基,能够与附近生物分子的C-H键反应,在生物分子和基质表面形成C-C共价键。

上述的偶联方法只适用于表面修饰因为分子扩散防止了体材料的穿透。在一项尝试将多肽链加入体材料的实验中,Duan 等人将目标多肽链连接到了聚丙烯树突状大分子的氨基末端上。14  剩下未连接多肽的树突状大分子氨基基团则作为了胶原偶联剂,通过天冬氨酸和谷氨酸的化学反应连接到了胶原上(方案1B),因此将多肽链加入到了体材料胶体上。通过这种方式,加入的多肽链的量可以通过调整和树突状大分子反应的多肽的量或调整凝胶偶联反应中用的修饰后树突状大分子的用量来进行调节。使用YIGSR,一种来源于层粘连蛋白的细胞粘附多肽,我们发现使用YIGSR多肽修饰的表面和体材料胶原基质都能够改善人体角膜上皮细胞和背根神经节凸起延伸的细胞粘附和繁殖。


 胶原结合区域融合重组蛋白的物理连接

生物分子还能通过静电作用和范德华力互相作用。这种作用可用于化学修饰不可能或者不适用的地方,尤其是功能蛋白或细胞的固定。但是,外部环境因素会严重影响到这些物理连接。比如,静电吸引导致的生物分子连接可能会渐渐被增强的离子强度,降低的pH,或是竞争反粒子影响。另一方面,当带电氢键或疏水基团间作用最强时,可能形成强非共价复合物。生物素-亲和素复合体就是这样一种极端强非共价连接。重组蛋白技术已经被用于添加特定氨基酸序列,这些序列能与它们的对应部分形成强连接。Dai et al发现含有TKKTLRT序列的六肽能够和胶原稳定结合,而不受外界环境影响。根据这一发现,通过DNA重组技术,在几种治疗蛋白中加入了TKKTLRT序列,使得这些改造过的蛋白能够与胶原特异连接.15,16。比如,胶原结合区域(CBD)-融合脑源性神经营养因子(BDNF)被加入胶原支架中,这样就能持续地刺激细胞形成神经组织,比如轴突。17 CBD融合血小板源生长因子-BB则可以固定在胶原膜上,促进皮肤溃疡创面表皮细胞再生,胶原沉淀,新形成组织区域毛细血管腔的形成。18 最近,有报道称CBD-VEGF修饰过的胶原支架能够促进尿道组织生成,增强犬科尿道缺损模型新尿道的功能(图1)。19

尿道重建术后6个月尿道正常(A,B)和新尿道的免疫荧光染色

图1.正常尿道(A,B)和尿道重建后新尿道(C,D,E,F)免疫荧光染色,含有抗全角蛋白抗体(ab86734)的大鼠单克隆抗体。上皮细胞覆盖了整个新尿道,上皮层的平均厚度与胶原-CBD-VEFG组的正常尿道相似(C,D)。但是,新尿道的中间区域并不是被完整的上皮层覆盖,胶原组经常能观察到瘘管(E,F)。胶原-CBD-VEGF组的平均上皮层厚度比胶原组(G)显著增厚。来自参考文献19.

 

除了蛋白质,细胞也能通过抗原-抗体连接暂时固定在胶原支架上。如果知道细胞特异性抗原抗体并且易于分离获得,就可以使用此方法。比如,在胶原凝胶中Sca-1阳性干细胞就能与anti-Sca-1单克隆抗体发生功能化作用20。当这一功能化胶原支架被移植到C57/BL6大鼠手术心脏缺损处作为补丁时,能观察到心肌细胞再生能力增强。

改变胶原的净电荷也会改变生物分子结构和生物分子与胶原的连接。在形成胶原-氨基葡聚糖(GAG)共沉淀前,胶原会经过脱氨、甲基化、氨基化反应的特异性修饰。21脱氨作用用中性羟基基团替代了赖氨酸和羟赖氨酸质子化ε-氨基基团的正电荷。另一方面,天冬氨酸合谷氨酸的羧基基团通过甲基化和氨基化反应被修饰。甲基化酯化羧基基团,提高了等电点。相反,氨基化将带有负电荷的羧基基团转化成了带有正电荷的氨基基团,提高了胶原的阳离子电荷密度。因为GAGs带有负电,经过6天,在氨基化胶原中保存的GAGs含量最高(60%),其次是在甲基化的胶原中(40%)。而在未经过处理的胶原和脱氨处理胶原中,大多数GAGs会在一天内丧失。

另外,胶原净电荷影响基质分子内自主装和纤维形态结构。21脱氨胶原形成粗纤维,网眼较大,颗粒较少;而氨基化胶原形成细纤维,网眼小,颗粒丰富,和天然兔子髓核基质的超微结构相似。尽管三种化学修饰的胶原支架都能够支持人体间质干细胞(MSCs)的生长,研究者发现长在氨基化胶原上的细胞整合素 αv表达量很低。人们猜测是GAGs和氨基化胶原的互作影响了整合素αvECM结合位点。

这些例子表明持续的生物化学信号能够显著影响细胞行为。胶原基质的机械特性是它能够形成有效组织工程支架的另一个重要因素。


 改变胶原基质的机械特性

人们做了许多尝试去调整胶原材料的机械强度,使得材料能够确保结构完整性的同时还能调节组织再生细胞移植的生物活性。过去通常使用具有细胞毒性的三聚氯氰(Aldrich货号C95501)来改变胶原分子间交联。22现在,可以通过无毒的一系列胺抗应PEG衍生物比如聚(乙二醇)双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)(Aldrich货号713783)来控制胶原胶体的弹性模量。改变胶原凝胶中PEG的数量能够被用来调整胶原凝胶的强度。23,24不同的胶原凝胶强度会影响胶体上细胞的粘附性和表型(图2)。

加入胶原凝胶的非活性PEG链能够通过增加结合水分子的数量调节胶的机械强度和单个胶原纤维的直径。25 当PEG浓度提高时,胶原胶会变得更软,同时胶原纤维直径增大,形成较大的肌末间胶原束。在胶原-EPG胶中培养的纤维母细胞对胶原纤维直径有反应,会形成较大的细胞束,细胞间通讯频繁,这些都是伤口愈合中收缩性原成肌纤维细胞的特征。

另外一种改变胶原胶强度的方法是引入带有丙烯酸甲酯基团的聚合物形成的互穿网络(IPN)。比如,人们使用4臂PEO-PPO嵌段共聚物(聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物,Tetronic®)来制备含有胶原的聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物胶体,为了构成带有丙烯酸甲酯基团的胶。相比纯胶原胶,预制胶原胶中的共聚物自由基交联反应导致胶体的强度急剧增加。26另外一种IPN胶是胶原纤维交联聚丙烯酰胺(PAAm)(Aldrich货号749222)形成的网络。这种胶通过胶原氨基基团和丙烯酰胺的乙烯基基团发生Michael反应进行制备。形成的胶原纤维化学连接到了PAAm胶上。

3D肝肿瘤球体增生凝胶弹性模量 E0效应。

图2 3D肝肿瘤球体增生凝胶弹性模量 E0效应。A,B)由纯胶原凝胶形成的球体(E0 = 9.7 kPa;第一行) 比胶原-PEG胶 (E0 = 4.0 kPa; 第二行)形成的球体体积大,排列也更无序。细胞内肌动蛋白用鬼笔环肽染色(绿色),细胞核用DAPI 染色(红色)。B)中图片是A)中球体放大图。C)在纯胶原胶中长大的球体相比在胶原-PEG中长大的球体有更高的整合素表达(黄色)。细胞核用DAPI 染色(红色)。D)胶原-PEG胶中球体相比纯胶原胶中的有更高的E-cadherin表达量(蓝色)。细胞核用DAPI 染色(红色)。比例尺为50 μm。来自参考文献23。

 

没有PAAm间交联反应的干扰。一项有趣的发现表明形成的IPN胶系统能够在不显著改变胶膨胀程度的同时控制其弹性模量。27 当这两个系数不相关时,装载有细胞或药物分子的胶就能够在保证它的结构完整度的同时允许生物分子运输透过。对于其他胶系统来说这是不可能实现的,因为胶的水分子通透性和强度总是相反的。结果就是强度足够的基质细胞活性和治疗效果总是欠佳。

相反地,半-IPNs(只有胶原彼此之间通过物理交联三维连接,二级共聚体链缠绕在胶原网络上)形成更为疏松的胶,有更低的储能模量和更高的降解率。因为有这些特性不同点,交联密度区域分布,粘弹性,水含量,微观宏观尺度基质空隙大小都可以通过调整胶中IPNs和半-IPNs模式来构建。28  这些在同一支架内进行的可控的不同结构修饰对于再生医学尤其有用,因为该领域所用支架经常需要同时培养多种细胞,而每一种细胞需要的基质机械特性各有不用。

最后一种调节胶原胶机械特性的方法是在胶中引入微粒子(图3)。比如在胶原胶中掺入水解聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)微粒(见产品表111)会同时增强胶的弹性和强度,因为PLGA微粒会和胶原纤维相连接。29 有趣地是,这一方法在大大增加了胶的弹性模量同时又不会改变生物分子在胶中的扩散能力。另外,当在模拟体液中培养或包裹间质干细胞时,PLGA微粒能够显著增强磷灰石状矿物质沉淀。微粒为成骨发生创造了更好的条件,加强了骨状结构的形成。

MSC包裹胶矿内矿物形成分析。A,B)矿物形成SEM图。

图3 MSC包裹胶矿内矿物形成分析。A,B)矿物形成SEM图。(A)MSC包裹胶原(B)PLGA-Col胶在成骨分化基质中培养0,5,10天后。C)胶内矿物形成EDS能谱分析。PLGA-Col胶含有10 mg/mLPLGA颗粒,而纯胶原胶含有0 mg/mL。来自参考资料29。


 总结

本文提供一系列方法和手段使人们能够根据所需要的生化,机械和运输特性改造胶原胶。文中重点介绍的方法为胶原材料结构,特性,功能的控制提供了可能,可用于再生生物医学相关的基础和应用生物研究。另外,材料设计中所包含的潜在规律还可能适用于细胞培养,给药和治疗中其他生物材料的制造。


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