分枝杆菌的鉴定

来源:Anandi MartinMicrobiology Focus Edition 2.2

PhD, Institute of Tropical Medicine, Mycobacteriology Unit, Belgium …. amartin@itg.be

 在10x显微镜下观察到的典型的结核分枝杆菌菌落

图1. 在10x显微镜下观察到的典型的结核分枝杆菌菌落

由分枝杆菌属菌种引起的疾病是世界上发病率和死亡率的重要原因。出于临床意义,按菌种水平鉴定分枝杆菌是重要的;有些菌种是致病的,有些则不是。

传统上,分枝杆菌通过基于培养的表型方法鉴定,例如形态学特征、生长速率、优选生长温度、颜色和一系列生化测试。测试工作费时费力而且困难重重,需要数周才能充分生长,并且有时可能会发生错误鉴别,因为不同的菌种可能具有难以区分的形态和生化特征。有多种不同的培养基用于分离分枝杆菌。最常用的是称为“Löwenstein-Jensen培养基”的蛋类培养基,其含有高浓度的孔雀绿,以克服其他细菌的污染。

在过去十年中,已经推出几种基于液体培养基的分枝杆菌培养的商业系统。已经证明液体培养基比用于分离临床标本中的分枝杆菌的蛋类固体培养基更敏感。结核分枝杆菌是生长缓慢的分枝杆菌,这意味着在初级分离中,它们在培养的第一周内几乎不显示任何可见的生长。在蛋类培养基上,它们产生特征性的无色素菌落,一般具有类似于面包屑的粗糙和干燥外观。在琼脂培养基上,菌落看起来平坦、干燥且粗糙,边缘不规则。结核分枝杆菌是烟酸阳性,被对硝基苯甲酸抑制,并显示出硝酸还原酶活性。确认分离株为结核分枝杆菌的其他试验对吡嗪酰胺敏感,在噻吩羧酸酰肼(TCH)上生长,在68℃不存在过氧化氢酶产生且不吸收铁。
 

根据Löwenstein-Jensen的TB培养基上的分枝杆菌菌落

 

图2. 根据Löwenstein-Jensen的TB培养基上的分枝杆菌菌落

通过显微镜直接检测分枝杆菌的Ziehl-Neelsen染色用于鉴定耐酸杆菌。分枝杆菌富含脂质的细胞壁使其对革兰氏染色具有抗性。它也可用于染色几种其他细菌,例如诺卡氏菌。用于染色的试剂有碳酸复红、酸-醇和亚甲蓝。染色后,耐酸杆菌呈现鲜红色。

非结核分枝杆菌(NTM)是普遍存在的生物,常常从环境来源中分离出来,包括地表水、自来水和土壤。最常与肺病相关的NTM菌种是鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。伤口皮肤 / 皮下感染就是因为分枝杆菌的快速生长造成的。偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌被认为是由局部环境菌株或受污染的商业外科材料、设备或注射用溶液引起的。快速生长的分枝杆菌通常在常规细菌培养基上生长,特别是在血琼脂板上,然而,由于它们需要较长时间才能形成可见的菌落(长达10天),它们在常规细菌学实验室中通常检测不到。它们也可以在大多数可用于分离分枝杆菌的培养基上分离。尽管大多数菌种的最适温度为30-32°C,但它们也会在36-37°C(分离结核分枝杆菌的标准温度)下生长。

在过去十年中,分子方法的进步促进了许多分枝杆菌菌种的快速、可靠的鉴定。已经评估了核酸探针、菌种特异性PCR、反向杂交和16S rRNA测序在临床实验室中的应用。可商购获得的第一种方法是AccuProbe(Gen-Probe Inc.),其基于菌种特异性DNA探针,其与rRNA杂交,从而鉴定几种重要的分枝杆菌,包括结核分枝杆菌复合体、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合体、堪萨斯分枝杆菌、和戈登分枝杆菌。最近,还推出了其他分子商业系统用于快速鉴定结核分枝杆菌复合体:INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2(比利时根特Innogenetics NV)、以及GenoType MTBC和GenoType Mycobacterium(德国内伦Hain Lifesciences)。INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2是一种系列探针测定,可同时检测和鉴定分枝杆菌属和16种不同的分枝杆菌菌种。它基于16S-23S rRNA基因间隔区中的核苷酸差异。GenoType MTBC和GenoType Mycobacterium也基于反向系列探针杂交测定,并且分别用于分化结核分枝杆菌复合体成员和鉴定包括结核分枝杆菌在内的35种分枝杆菌。GenoType MTBC基于对结核分枝杆菌复合体特异的23S rRNA基因片段、gyrB序列多态性、以及用于鉴定牛分枝杆菌BCG的RD1缺失。几种“内部”技术也可用16S rRNA基因测序作为参考标准,所有其他新技术通常都与之比较。
 

根据Löwenstein-Jensen在TB培养基上生长的不同分枝杆菌菌种

图3. 根据Löwenstein-Jensen在TB培养基上生长的不同分枝杆菌菌种
 

 参考文献

  1. Tortoli E. Clinical manifestations of nontuberculous mycobacteria infections. Clin Microbiol Infect. 2009 Oct;15(10):906-10.
  2. Palomino JC. Molecular detection, identification and drug resistance detection in Mycobacterium tuberculosis. FEMS Immunol Med Microbiol. 2009 Jul;56(2):103-11.