微生物学理论:培养基制备

微生物需要营养,营养是指微生物生长与繁殖所需的能量来源和特定环境条件。在自然环境中,微生物已经适应了最适合其需要的栖息地,然而在实验室中,这些要求必须通过培养基来满足。这基本上是一种水溶液,其中添加了所有必需的营养素。根据营养素的类型和组合,可以制做不同类别的培养基。
 

 培养基制备的类别

复合培养基营养丰富,含有植物或动物组织的水溶性提取物(例如蛋白胨和胰蛋白胨之类的酶消化的动物蛋白)。通常加入糖(常常是葡萄糖),作为主要的碳和能量来源。提取物与糖的组合产生富含矿物质和有机营养素的培养基,但由于确切的组成未知,因此培养基称为复合物。

成份确定的培养基是指精确计量浓度的纯成分溶解于双蒸水所制成的培养基,即培养基的确切化学组成是已知的。通常,它们含有简单的糖作为碳和能量来源,是一种无机氮源,另外还含有各种矿物盐和必要的生长因子(纯化的氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶)。

选择性/差异性培养基是基于上述两类中的任一类制成的培养基,并补充有促进或抑制生长的添加剂。添加剂可以是物种或生物选择性的(例如特定底物,或者抑制所有真核生长的抑制剂,例如环己酰胺(artidione,放线菌酮),并且通常用于防止混合培养物中的真菌生长)。

培养基  用途
复合培养基 培养大多数异养生物
成份确定的培养基 培养特定的异养生物,通常是化学自养生物、光合自养生物、和微生物检测的必需品
选择性培养基 抑制不需要的微生物,或促进所需微生物的生长
差异性培养基 区分特定微生物菌落与其他微生物菌落
增殖培养基 类似于选择性培养基,但旨在将所需微生物的数量增加到可检测的水平,而不刺激其余的细菌群体
减灭培养基 培养专性厌氧菌

必需营养素的混合物可用作液体培养基,亦可加入固化剂。“琼脂”是由海藻生产的天然多糖,是最常用来添加到培养基中的固化剂(最终浓度通常为1.5%w/v)。如果怀疑琼脂水解,则使用硅胶作为替代固化剂。
 

 培养基制备的蛋白质水解物

复合培养基通常含有蛋白质水解产物,它们是生长培养基中极好的氨基酸、肽和蛋白质的天然来源。这是含氮营养素的最重要来源。它们通常通过天然产物的酶消化或酸水解获得,例如动物组织、乳汁、植物或微生物培养物。可用的蛋白质水解物(也称为蛋白胨)的数量是巨大的,并且可以促进和维持大多数常见生物的生长。对于酶消化,通常采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰液酶混合物。下面是常用的表达和定义。

术语  释义
胰蛋白酶消化 通过用胰蛋白酶消化蛋白质产生蛋白质水解物。
胃蛋白酶消化 蛋白质被胃蛋白酶消化。
胰液消化 蛋白质被胰液的混合酶消化。
蛋白眎消化(Proteose Peptonet) 肉蛋白的混合酶消化。它富含具有较高分子量的肽。
胰蛋白胨 酪蛋白被胰蛋白酶消化。
胰蛋白眎Tryptose)/Tryplose 动物蛋白的混合酶消化。消化条件使得它含有许多不同的肽,包括具有较高分子量的肽(蛋白眎)。

 

 无菌技术

在接种所需的微生物之前,微生物培养基以及与其接触的所有材料都必须是无菌的。在任何后续处理细菌培养物期间,必须使用无菌技术排除不需要的生物或污染生物。

灭菌意味着完全破坏包括孢子在内的所有微生物,这可使用热、化学品、辐射、过滤来实现。



使活蛋白变性和凝固。有各种形式的热灭菌。

炙热

将接种丝或环置于本生灯火焰中,直至它们变红,从而达到灭菌目的。

湿热

湿热(蒸汽)比干热更容易破坏细菌。通常用于培养基、水溶液的灭菌以及废弃培养物的销毁。必须首先除去空气,以达到成功灭菌所需的121°C。这通过使用杀菌釜(高压锅的技术版本)来实现,该杀菌釜自动循环进行压力下加热所需时间。

干热

通常用于可能会被蒸汽腐蚀或在使用前必须保持干燥的材料。这些包括金属器具、玻璃培养皿、烧瓶、移液管以及棉绒。在实践中,干热灭菌需要比蒸汽灭菌更长的时间间隔和更高的温度,例如蒸汽灭菌121℃下15分钟,干热灭菌160℃下120分钟。

化学

通常用于精密设备,如光学仪器和电气设备,这些设备会被热损坏。由于所用化学品的毒性,这不是最流行的灭菌形式。所用化学品包括:气态环氧乙烷(其使微生物细胞化合物的氨基、巯基、羧基和羟基烷基化),甲醛(用作熏蒸剂),以及无菌包装中使用的过氧化氢蒸气。

辐射

用于热敏材料和环境样品,如土壤和沉积物,需要避免由热引起的结构变化。使用两种形式的辐射:

紫外线(UV)

启动原子激励,核酸导致致命突变。紫外线不能穿透材料,因此主要用于表面处理,例如层流工作台、以及空气和水。

电离辐射

可以穿透样品,导致细胞内电离。60Co a源产生的γ辐射用于对复杂基质(例如土壤和食品)进行灭菌。微生物在缺氧条件下(2-5x)和冷冻样品中显示出增强的抗辐射性。

过滤

过滤灭菌通过排除而不是破坏微生物来进行。这种方法对用户安全,适用于敏感液体和气体。目前使用三种类型的过滤器:

深度过滤器

它们由填充有纤维材料(例如玻璃棉或棉绒)的处理柱制成。回转、盘绕的纤维捕捉颗粒,从而达到过滤目的,它们几乎不防碍液体流动,主要用于过滤气体,或者用作易于堵塞的膜过滤器的预过滤器。

滤膜过滤器

通过将颗粒筛除达到过滤目的。它们的有效性取决于滤膜孔的大小以及存在的静电吸引力。微生物学中最常用的过滤器通常由醋酸纤维素或硝酸纤维素制成。滤除下列颗粒所需的滤膜孔径:
酵母:0.45-1.2 μm
细菌:0.2 μm
病毒和支原体:0.01-0.1 μm
滤膜过滤通常用于热敏物质,例如维生素溶液。滤膜在使用前必须进行热灭菌。

成核径迹(Nuclepore)过滤器

这些过滤器由非常薄的聚碳酸酯薄膜组成,这些薄膜经过核辐射处理,然后用化学品蚀刻,形成非常均匀的垂直孔。它们用于过滤与滤膜过滤器所过滤的相同的材料,但缺点是它们更容易堵塞。
   

培养基补剂

最常用的培养基补剂、灭菌方法、溶解度表
 

物质 25°C时的水溶性 说明/灭菌方法
放线菌酮
(环己酰胺)
2.1 g/100 ml 通过在pH7的水溶液中煮沸1小时来破坏。
过滤消毒
L(+)-阿拉伯糖

1 g/1 ml  
精氨酸* 15 g/100 ml 稳定的bly碱性溶液,吸收CO2 pK1, 2.18 pK9.09 pK313.2
天冬酰胺

2.16 g/100 ml 100℃下在水溶液中稳定,在酸性溶液中水解
生物素

22 mg/100 ml 0.01%溶液的pH值 = 4.5
酸性溶液可以加热灭菌
半胱氨酸* 可溶 中性弱碱性溶液被氧化成胱氨酸pK1,
1.71 pK2   8.33 pK3 10.78
糊精 可溶于3份沸水中  
Ehrlichs试剂果糖 可溶
可溶
 
品红 1 g/7 ml  
半乳糖 可溶 a) 可溶于0.5份水,易溶于热水
b) 在17℃下可溶于1.7份水
葡萄糖 1 g/1 ml 0.5M 水溶液的pH = 5.9
丙三醇 可混溶  
糖原 可溶 乳白色
乳糖 21.6 g/100 ml a) 1 g/5 ml
b) 1 g/2.2 ml,15°C时
麦芽糖 可溶 mp 102-103°C
甘露醇 可溶  
烟酸 可溶 在120°C下高温高压灭菌20分钟仍稳定
鸟氨酸* 可溶 碱性水溶液pK, 1.94 pK2 8.65 pK3 10.76
苯丙氨酸*   L 29.6 g/L,25°C时
D 1 g/35.5ml,16°C时
DL 14.11 g/L,25°C时
pK1 2.58 pK2 9.24
刃天青 不溶于水
溶于稀碱金属氢氧化物
指示剂
在20ml 1N NaOH + 水溶液中加入0.1g,配成500ml
pH 3.8时为橙色,pH 6.5时为深紫色
核糖 可溶  
柠檬酸 20°C时可溶59.2 % 0.1N溶液的pH = 2.2
山梨糖醇 可溶,最高83% mp 100/112°C
淀粉 不可溶  
蔗糖 1g/0.5ml  
EDTA(二钠盐) 可溶 用于培养基中的复合铁
EDTA(酸) 不可溶  

所有氨基酸原液均可在120℃下高温高压灭菌20分钟。
 

培养基组分的相互作用

在进行培养基组分起着重要作用的研究(例如毒性研究)中,必须注意观察培养基组分之间可能发生的各种相互作用。

酵母,蛋白胨和 氨基酸 结合大量的二价Hg、Pb、Ag和Cu离子
葡萄糖 表现出非选择性金属结合,可导致必需离子的金属缺乏或
减少毒性离子的毒性。
EDTA 螯合必需的微量金属,导致缺乏; 通过添加其他金属(例如Cu和Fe)可以逆转。
NaCI 增加Zn毒性(形成Zn-氯络合物),降低Cd毒性。
琼脂 在固体培养基中,Sn毒性增加(形成可溶性毒性锡琼脂络合物)。
硅胶 降低Sn、Cd、Pb、Ni和Zn二价离子的毒性。
磷酸盐 不溶性磷酸盐沉淀*降低毒性离子的毒性
  (例如Cd和Pb)或导致必需离子(例如Fe)缺乏
碳酸盐 不溶性碳酸盐的沉淀
Pb毒性下降
柠檬酸盐 非选择性金属结合
Tris 非选择性金属结合

*可以通过添加HEPES缓冲液来减少磷酸盐。